HMGB1和CXCL13促進狂犬病病毒誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)的機制研究.pdf

1、狂犬病是由狂犬病病毒(RABV)引起的人畜共患傳染病，人和動物一旦發(fā)病，死亡率幾乎是100％。在世界大多數(shù)地區(qū)，狂犬病仍然是一個重要的公共安全問題，每年至少有59000人死于狂犬病，嚴(yán)重威脅人類的健康安全，給人們帶來了沉重的心理負擔(dān)。發(fā)達國家已經(jīng)通過大規(guī)模接種疫苗基本控制了人類狂犬病的蔓延，而發(fā)展中國家人類狂犬病的發(fā)生仍舊普遍。幾乎所有的(99％)人類狂犬病的死亡由犬咬所致，因此我們迫切需要一個廉價有效的疫苗來控制或消除發(fā)展中國家由犬介

2、導(dǎo)的狂犬病。
　　目前，狂犬病疫苗的研究多種多樣，但開發(fā)RABV弱毒活疫苗和重組活載體疫苗是控制或治療狂犬病最具有潛力的方法。高遷移率族蛋白1(HMGB1)是一個高度保守的非組蛋白染色體蛋白，促進樹突狀細胞的成熟，介導(dǎo)非感染性炎癥反應(yīng)中的免疫反應(yīng)。趨化因子CXCL13招募濾泡輔助性T細胞和B淋巴細胞到達二級淋巴器官，有助于二級淋巴器官中B淋巴濾泡的形成和發(fā)育。我們以前的研究表明，過表達細胞因子或趨化因子，如巨噬細胞集落刺激因子(G

3、M-CSF)或巨噬細胞炎性蛋白1α(MIP-1α)等，能夠增強RABV弱毒活疫苗的免疫原性。延續(xù)這一思路，為了獲得更加高效的RABV弱毒活疫苗，我們選定了HMGB1和CXCL13這兩個分子進行RABV弱毒活疫苗的開發(fā)，并研究其作用機制。
　　本論文中主要開展了以下兩項研究:
　　在第一項研究中，將鼠源HMGB1的兩個核定位序列中的所有絲氨酸突變成丙氨酸，在序列前面融合分泌型信號肽序列，使其不能夠進入細胞核而分泌到細胞外，從而

4、構(gòu)建突變型HMGB1(HMGB1mut)。然后，將HMGB1mut插入到RABV弱毒株LBNSE的基因組中，并拯救重組RABV，研究HMGB1mut對RABV免疫原性的影響及其機制。間接免疫熒光(IFA)和蛋白免疫印跡(Western blotting)結(jié)果表明，LBNSE-HMGB1mut成功表達HMGB1 mut，并分泌到培養(yǎng)基上清中。有意思的是，野生型HMGB1(HMGB1wt)和HMGB1mut均能夠輕微抑制RABV在BSR和N

5、A細胞中的復(fù)制（滴度下降0.5 Log FFU/ml），HMGB1wt和HMGB1mut的表達抑制了RABV誘導(dǎo)的細胞凋亡，而對細胞活性沒有影響。體外實驗表明，HMGB1 mut能夠顯著促進骨髓源樹突狀細胞的成熟;體內(nèi)實驗表明，LBNSE-HMGB1mut能夠顯著招募和/或成熟小鼠體內(nèi)的樹突狀細胞，從而增加濾泡輔助性T細胞、生發(fā)中心B細胞以及漿細胞的數(shù)量。進一步研究發(fā)現(xiàn)，免疫LBNSE-HMGB1mut的小鼠比免疫LBNSE和免疫LBN

6、SE-HMGB1wt的小鼠產(chǎn)生更多的RABV中和抗體(VNA)，并提供機體更好的保護，且對小鼠沒有明顯的危害作用?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)使我們更好地理解HMGB1mut在RABV誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)中的作用，有助于開發(fā)更加高效的RABV疫苗。該研究首次在重組活病毒疫苗中證實HMGB1在不明顯影響病毒復(fù)制的情況下促進病毒誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)，為未來RABV疫苗的開發(fā)奠定一定基礎(chǔ)。
　　在第二項研究中，將鼠源趨化因子CXCL13插入到RABV弱毒

7、株LBNSE的基因組中，并拯救重組RABV，研究CXCL13對RABV免疫原性的影響及其機制。通過ELISA鑒定了CXCL13的表達。體外和體內(nèi)實驗表明，CXCL13的表達并沒有影響病毒的生長特性。LBNSE-CXCL13表達的CXCL13在體外和體內(nèi)均具有生物學(xué)活性，都能夠招募表達其受體CXCR5的細胞。進一步研究表明，過表達CXCL13促進了引流淋巴結(jié)的生長發(fā)育和生發(fā)中心的形成。表達CXCL13的重組RABV弱毒活疫苗比親本病毒LB

8、NSE和LBNSE-GM-CSF誘導(dǎo)機體產(chǎn)生更多的GCB細胞，進而激活更多的漿細胞，提升VNA滴度，并提供機體更好的保護。此外，CXCL13的血漿濃度、RABV VNA滴度和GC活性三者之間極顯著正相關(guān)，CXCL13是檢測RABV誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)的一個血漿標(biāo)志?？傊?，CXCL13是一個有潛力的RABV佐劑分子，可以通過血漿CXCL13的濃度間接評判RABV疫苗的免疫效果。結(jié)合之前的研究，發(fā)現(xiàn)了CXCL13不同于以往的促進RABV誘導(dǎo)的