MMP-2，MMP-9和TIMP-2啟動(dòng)子區(qū)基因多態(tài)性與侵襲性牙周炎相關(guān)性的研究.pdf

1、牙周病是一類涉及到細(xì)菌微生物侵犯和宿主反應(yīng)等因素影響的常見病之一；細(xì)菌是牙周炎的始動(dòng)因素，但是細(xì)菌的作用可能會(huì)被宿主反應(yīng)不同所改變。侵襲性牙周炎是常發(fā)生在全身健康的青少年和年輕成年人、以牙周支持組織快速降解破壞為特征的一類牙周炎；大量的遺傳學(xué)研究認(rèn)為罹患侵襲性牙周炎的個(gè)體涉及遺傳易感因素。 迄今大多數(shù)遺傳基因易感因素和牙周病相關(guān)性研究主要采用候選基因多態(tài)性(polymorphisms)的關(guān)聯(lián)研究；已有研究多關(guān)注免疫系統(tǒng)和炎性因子

2、的基因，包括白介素-1(IL-1)，人類白細(xì)胞抗原（HLA），維生素D受體，F(xiàn)cγ受體等基因；實(shí)際上炎性因子刺激宿主細(xì)胞產(chǎn)生過量的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)，最終導(dǎo)致了牙周組織的降解和破壞。MMPs家族是由20多種鋅離子依賴性內(nèi)切酶組成，在胚胎發(fā)育、炎癥反應(yīng)和腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等中發(fā)揮重要作用；尤其在炎癥反應(yīng)中加速白細(xì)胞募集、細(xì)胞因子釋放和促進(jìn)基質(zhì)降解改建。明膠酶是MMPs家族的主要成員，

3、包括MMP-2(明膠酶A)和MMP-9(明膠酶B)；它們作用底物廣泛，包括IV型膠原、明膠、彈性蛋白等。MMP-2主要由成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和破骨細(xì)胞表達(dá)；MMP-9主要由中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生。MMPs的表達(dá)活化受到轉(zhuǎn)錄調(diào)控、底物特異性、內(nèi)源性抑制劑—組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)三方面的平衡調(diào)節(jié)。大量臨床研究證實(shí)在牙周炎活躍期的齦溝液、牙

4、齦中包括MMP-2、MMP-9在內(nèi)的MMPs水平明顯升高，MMPs/TIMPs比例失衡。 近年來國內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)在不同種族中MMP-1啟動(dòng)子區(qū)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)與慢性牙周炎或侵襲性牙周炎易感性有一定相關(guān)性。促使人們把目光投向非炎癥系統(tǒng)的MMPs家族基因作為候選基因，探尋其基因多態(tài)性和牙周炎的關(guān)系。近來在MMP-2基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)-1306bp位點(diǎn)胞嘧啶替換為胸

5、腺嘧啶（C→T）形成SNP，改變了CCACC盒而影響轉(zhuǎn)錄水平；在MMP-9啟動(dòng)子區(qū)-1562bp位點(diǎn)C→T產(chǎn)生的SNP對(duì)轉(zhuǎn)錄也產(chǎn)生顯著影響，T等位基因表達(dá)水平升高；TIMP-2基因啟動(dòng)子區(qū)-418bp位點(diǎn)上鳥嘌呤轉(zhuǎn)換為胞嘧啶(G→C)，影響到Sp1結(jié)合位點(diǎn)導(dǎo)致TIMP-2基因轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào)，進(jìn)而可能影響到TIMP-2和MMP-2之間的平衡。本課題將對(duì)MMP-2，MMP-9和TIMP-2啟動(dòng)子區(qū)基因多態(tài)性與侵襲性牙周炎相關(guān)性進(jìn)行研究。

6、 牙周?？齐娮硬v是對(duì)牙周病臨床病例樣本進(jìn)行牙周臨床指標(biāo)統(tǒng)計(jì)分析的理想工具，對(duì)牙周臨床科研工作的開展起著不可替代的作用。隨著牙周病學(xué)研究的快速發(fā)展和口腔數(shù)字化管理的普及，亟需牙周?？齐娮硬v，加快國內(nèi)牙周電子病歷的研制開發(fā)勢(shì)在必行。為此本課題開發(fā)構(gòu)建了牙周專科電子病歷。 本課題還利用臨床搜集的AgP患者牙齦組織標(biāo)本，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法對(duì)MMP-9、TIMP-2的表達(dá)進(jìn)行定位及半定量分析，探討了MMP-9、TIMP-2在侵襲

7、性牙周炎不同基因型牙齦組織中的表達(dá)情況。 第一部分牙周電子病歷的構(gòu)建本研究 采用微軟IIS（Internet Information Server）的ASP(Active Server Page)服務(wù)器腳本語言和ACCESS數(shù)據(jù)庫，實(shí)現(xiàn)了牙周臨床指標(biāo)數(shù)據(jù)錄入統(tǒng)計(jì)和牙周健康狀況全景形象展示，較為全面細(xì)致地反映患者牙周狀況，可以滿足牙周專科和本課題臨床病例牙周指數(shù)統(tǒng)計(jì)的需要，為發(fā)展國內(nèi)牙周?？齐娮硬v做出有益探索。

8、 第二部分MMP-2，MMP-9和TIMP-2啟動(dòng)子區(qū)基因多態(tài)性與侵襲性牙周炎相關(guān)性研究 研究樣本為79名廣泛型侵襲性牙周炎(generalized aggressive periodontitis，G-AgP)患者和128名臨床牙周健康對(duì)照者；本研究樣本的檢驗(yàn)效能為75％，樣本量大小符合檢測(cè)效能的要求。Chelex-100法從頰拭子脫落細(xì)胞中提取DNA，采用聚合酶鏈反應(yīng)-變性高效液相色譜法（denaturing high- p

9、erformance liquid chromatography，DHPLC）和限制性片段長度多態(tài)性分析(restriction fragment length polymorphism，RFLP)法分別檢測(cè)樣本MMP-2-1306bpC/T，MMP-9-1562 C/T和TIMP-2-418G/C啟動(dòng)子區(qū)基因多態(tài)性；分析兩組中基因型分布、等位基因頻率，以及MMP-2和TIMP-2復(fù)合基因單體型。 結(jié)果：Chelex-100法

10、所提取DNA完全可以滿足本實(shí)驗(yàn)候選基因的SNP檢測(cè)；G-AgP組和對(duì)照組按照年齡和性別t檢驗(yàn)p = 0.157和0.124，兩組的性別、年齡匹配。經(jīng)卡方檢驗(yàn)兩組中MMP-2，-9，和TIMP-2基因型符合哈代-溫伯格平衡（Hardy-Wenberg equilibrium）(2χ= 0.001~0.83,p>0.05)?？ǚ綑z驗(yàn)均經(jīng)過耶茨校正(Yates’ correction)，多重卡方檢驗(yàn)校正p＜0.017為有顯著性意義。MMP-2

11、-1306C/T、MMP-9-1562C/T啟動(dòng)子區(qū)基因多態(tài)性在G-AgP組和對(duì)照組中最常見的基因型為CC，而TT基因型少見，各基因型在兩組的分布沒有差異(p＞0.05)。等位基因頻率在兩組中也沒有顯著性差異(p=0.707，0.858)。TIMP-2啟動(dòng)子區(qū)基因多態(tài)性在G-AgP組和對(duì)照組中基因型和等位基因頻率的分布：在G-AgP組GC+CC基因型（48.1％）比對(duì)照組（32.0％）明顯增多[p = 0.030; OR: 1.97,

12、95％ CI: (1.11;3.50)]，這種差異經(jīng)過多重卡方檢驗(yàn)校正后失去顯著性意義(p＞0.017)；TIMP-2-418G和-418C等位基因頻率在G-AgP組分別為71.5％和28.5％，而在對(duì)照組分別為82.4％和17.6％，等位基因-418C在G-AgP組的檢出頻率顯著高于對(duì)照組[p=0.013; OR: 1.87, 95％ CI: (1.17;2.99)]。MMP-2和TIMP-2 復(fù)合基因單體型分析以常見的MMP-2-1

13、306CC+TIMP-2-418GG基因型作參照，兩組中復(fù)合基因型分布差異沒有顯著性意義(p＞0.05)，即沒有顯示出MMP-2和TIMP-2復(fù)合基因的疊加作用和我國漢族人群侵襲性牙周炎有相關(guān)性。 結(jié)論：MMP-2-1306C/T、MMP-9-1562C/T啟動(dòng)子區(qū)基因多態(tài)性可能不是我國漢族人群侵襲性牙周炎的遺傳易感因素；TIMP-2-418G/C啟動(dòng)子區(qū)基因多態(tài)性與我國漢族人群廣泛型侵襲性牙周炎有相關(guān)性，TIMP-2-418

14、C等位基因可能是我國漢族人群廣泛型侵襲性牙周炎的遺傳易感因素。 第三部分MMP-9, TIMP-2在不同基因型侵襲性牙周炎患者牙齦組織中的表達(dá) 本部分對(duì)6例健康牙齦標(biāo)本和9例AgP患者牙齦標(biāo)本，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法，按照MMP-9-1562bpC/T、TIMP-2-418G/C不同基因型分組，觀察牙齦組織中MMP-9、TIMP-2的表達(dá)，目的在于分析MMP-9、TIMP-2在侵襲性牙周炎不同基因型的齦組織表達(dá)情況。

15、 結(jié)果：在正常牙齦標(biāo)本中MMP-9和TIMP-2幾乎不表達(dá)，而在侵襲性牙周炎患者的牙齦組織中MMP-9和TIMP-2表達(dá)明顯。MMP-9主要在固有層炎性細(xì)胞密集區(qū)陽性表達(dá)；TIMP-2多在上皮層表達(dá)。在病例組，含有MMP-9-1562T等位基因和不含MMP-9-1562T等位基因的牙齦組織中MMP-9表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)量和平均灰度值無顯著差別；不含TIMP-2-418C等位基因的牙齦組織中TIMP-2表達(dá)陽性細(xì)胞平均灰度值雖然高于含有