ROS調(diào)控正常肝細胞增殖—靜息轉(zhuǎn)變的信號作用及機制研究.pdf

1、研究背景
　　肝細胞通過調(diào)節(jié)自身增殖、靜息狀態(tài)的相互轉(zhuǎn)變參與肝臟發(fā)育、再生、損傷修復等多種重要的生理病理過程。然而肝細胞增殖啟動、終止的具體信號機制尚不清楚。初步研究顯示，活性氧（ROS）在此動態(tài)轉(zhuǎn)換過程中，具有不同的反應和作用。
　　實驗目的
　　通過不同發(fā)育時期的肝細胞模型和肝切除動物模型，研究生長發(fā)育及肝再生過程中ROS水平變化與肝細胞增殖-靜息轉(zhuǎn)變的關(guān)系，闡明ROS信號在誘導肝細胞增殖-靜息轉(zhuǎn)變過程中的關(guān)鍵地位

2、及作用機制，為進一步認識肝細胞增殖-靜息轉(zhuǎn)變的自我調(diào)控過程，尋找新的調(diào)控靶點奠定基礎(chǔ)。
　　實驗方法與研究方案
　　1.觀察大鼠肝臟發(fā)育過程中ROS的調(diào)控及ROS與肝細胞增殖→靜息過渡的關(guān)系
　?、俜蛛x不同發(fā)育階段的肝細胞，檢測ROS水平及細胞周期變化。
　?、跈z測以Nrf2為核心的抗氧化產(chǎn)物的表達及活性變化。
　　2.體外實驗研究ROS調(diào)控肝細胞增殖周期開、關(guān)的量效關(guān)系
　?、俑鶕?jù)前期實驗的觀察結(jié)果

3、，分別選擇胎齡15-16天和成年SD大鼠的肝細胞作為研究對象進行原代分離培養(yǎng)。
　?、谕ㄟ^直接干預增殖或靜息肝細胞內(nèi)的ROS水平，觀察胞內(nèi)ROS水平的改變對細胞增殖、細胞周期及CyclinD、Rb、PCNA表達的影響，明確ROS是否在肝細胞增殖-靜息轉(zhuǎn)變中起著信號調(diào)控作用，同時闡明其作用的劑量-效應規(guī)律。
　　3.ROS對MAPKs的選擇性磷酸化作用及ROS-MAPKs-CyclinD-Rb調(diào)控通路的研究
　?、俑鶕?jù)以

4、上結(jié)果選擇合適的干預劑量，通過降低增殖肝細胞內(nèi)ROS水平誘導其靜息或升高靜息肝細胞內(nèi)ROS水平誘導其增殖后，觀察MAPKs磷酸化改變，證實ROS對MAPKs的選擇性磷酸化激活作用。
　?、诟深A胞內(nèi)ROS濃度的同時，有針對性的采用特異性MAPKs抑制劑，觀察胞內(nèi)ROS水平、細胞增殖活性、細胞周期及相關(guān)蛋白表達、MAPKs磷酸化改變，進一步證實ROS信號的上游地位，探討ROS-MAPKs-CyclinD-Rb調(diào)控通路在肝細胞增殖-靜息

5、狀態(tài)轉(zhuǎn)變中的作用。
　　4.體內(nèi)實驗研究成年大鼠肝臟微環(huán)境H2O2水平變化對細胞靜息狀態(tài)的影響及作用機制。
　?、貵OX處理大鼠，在生理范圍內(nèi)升高肝臟微環(huán)境的H2O2水平，觀察肝臟增殖能力及ERK活性改變，以證明ROS在肝細胞增殖自我調(diào)控機制中起“閥門樣”作用。
　　②在GOX處理的基礎(chǔ)上給予CAT清除肝內(nèi)H2O2，觀察能否對抗GOX的效應，以證明GOX的促增殖作用與其肝內(nèi)代謝產(chǎn)物H2O2直接相關(guān)。
　?、墼贕O

6、X處理的基礎(chǔ)上給予MEK1/2選擇性抑制劑PD184161，觀察抑制ERK通路能否遏制GOX的增殖啟動效應，以證明ERK通路激活是H2O2啟動肝細胞增殖的重要機制。
　　5.體內(nèi)實驗研究ROS信號對肝再生過程的調(diào)控
　　采用成熟的大鼠70％肝切除模型，取不同時間點觀察肝再生過程中ROS水平變化與肝組織增殖能力變化。同時正、反向干預肝再生早期的ROS水平，觀察對肝再生及增殖相關(guān)信號通路的影響，探討ROS平衡在肝再生啟動中的作用

7、。
　　實驗結(jié)果
　　1.SD大鼠發(fā)育過程中，出生后15天，80％以上的肝細胞處于G0期，PCNA、Ki67、CyclinD、AFP表達下降，Rb磷酸化水平明顯降低，說明出生后2周左右，SD大鼠肝細胞結(jié)束增殖、過渡至穩(wěn)定的靜息狀態(tài)。我們的研究發(fā)現(xiàn)，線粒體是發(fā)育過程中肝細胞內(nèi)ROS的主要來源，Nrf2及下游的抗氧化產(chǎn)物在不同的發(fā)育時期選擇性表達，兩者共同作用的結(jié)果為，伴隨著肝細胞由增殖過渡到靜息，ROS水平顯著降低，提示ROS

8、與細胞增殖-靜息轉(zhuǎn)變密切相關(guān)。
　　2.采用NAC處理ROS水平相對較高的胚胎肝細胞，能顯著降低ROS水平，抑制細胞增殖，誘導細胞靜息，而p38抑制劑能顯著阻斷NAC誘導的細胞靜息作用。采用H2O2處理ROS水平相對較低的成年肝細胞，能顯著升高ROS水平，促進細胞增殖，而ERK抑制劑能顯著阻斷H2O2誘導的細胞增殖作用。以上結(jié)果說明，調(diào)控ROS可以通過選擇性激活ERK或p38誘導細胞增殖或靜息。
　　3.GOX可使肝臟ROS

9、水平增高，改變肝臟的靜息狀態(tài)，促進增殖。CAT可以降低ROS水平，阻斷GOX的增殖啟動作用，說明GOX的促增殖作用與其肝內(nèi)代謝產(chǎn)物H2O2直接相關(guān)。ERK特異性抑制劑可以顯著阻斷GOX的促增殖效應，但效果弱于CAT，說明ERK通路只是ROS啟動細胞增殖的調(diào)控通路之一。
　　4.ROS水平在肝再生過程中變化先高后低，與肝切除后再生啟動與終止密切相關(guān)。肝再生早期，GOX處理可以升高肝臟ROS水平，加重肝切除后氧化應激，抑制肝再生，而C

10、AT處理可以降低肝臟ROS水平，減輕肝切除后氧化應激，但同樣抑制肝再生。說明肝再生過程中的ROS水平被精確調(diào)控在“所需”范圍內(nèi)，可能是肝再生啟動與進展的關(guān)鍵信號因素。
　　結(jié)論：
　　本課題通過觀察正常肝臟發(fā)育及肝細胞再生過程中ROS的變化規(guī)律，探討ROS信號改變與肝細胞增殖-靜息相互轉(zhuǎn)變的內(nèi)在聯(lián)系，從“ROS水平的相對高低是維持肝細胞增殖或靜息狀態(tài)所必需的”這一新視角出發(fā)研究肝細胞周期自我調(diào)控的實現(xiàn)途徑，證明了“ROS信號