糖皮質(zhì)激素和TGF-β1對人成骨肉瘤細(xì)胞RhoB的誘導(dǎo)作用、機(jī)制及生物學(xué)意義.pdf

1、糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid，GC)是人體內(nèi)的重要激素，除了具有調(diào)節(jié)糖、脂肪和蛋白質(zhì)的生物合成和代謝的作用，GrC還是體內(nèi)重要的抗炎激素和應(yīng)激激素，隨著對GC生物學(xué)作用研究的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)GC還能夠調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和粘附等。GC在臨床上被廣泛用于治療慢性非感染性炎性疾病、過敏性疾病及器官移植等，但大量的使用GC會導(dǎo)致骨質(zhì)疏松(osteoporosis)，臨床上稱為糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥(gluccorticoi

2、d induced osteoporosis，GIOP)。以往對GIOP的研究多放在GC影響鈣穩(wěn)態(tài)和對性激素的作用上，對骨細(xì)胞的直接影響也多放在GC增強(qiáng)破骨細(xì)胞的活性上，而GC對成骨細(xì)胞的作用研究不多；目前有許多研究發(fā)現(xiàn)GC能夠直接抑制成骨細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡，但具體的分子機(jī)制還尚未闡明。深入研究GIOP的分子機(jī)制將有助于為臨床治療提供理論依據(jù)。
　　 RhoB隸屬于小G蛋白家族Rho亞族，Rho亞族主要包括RhoA，

3、RhoB和RhoC，它們參與了體內(nèi)多種生理或者病理過程，比如細(xì)胞粘附、運(yùn)動，增殖、存活和炎癥等。RhoB雖然在蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)上和RhoA、RhoC相似(～90％)，但RhoB卻有許多特殊性。比如，大量文獻(xiàn)表明，RhoB能夠抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；而RhoA和RhoC則分別促進(jìn)細(xì)胞的惡變和腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。另外，RhoB是個誘導(dǎo)型蛋白，多種因素，例如放射線、化療藥、熱、低氧、多種生長因子等都能誘導(dǎo)細(xì)胞RhoB的表達(dá)；而RhoA和RhoC

4、則是組成型表達(dá)的蛋白。RhoB幾乎是和RhoA、RhoC同時發(fā)現(xiàn)的，由于和RhoA同源性太高，人們把注意力主要放在對RhoA的研究上，直到發(fā)現(xiàn)RhoB具有抑制腫瘤的功能，人們才開始把目光轉(zhuǎn)向RhoB?？傊鄬τ赗hoA，迄今對RhoB的研究有限，對其功能及調(diào)控機(jī)制的了解還很不夠。
　　 轉(zhuǎn)化生長因子β1(Transforming growth factorβ1，TGF-β1)是成骨細(xì)胞表達(dá)最多的細(xì)胞因子之一，它在細(xì)胞增殖、分化

5、、凋亡、粘附和游走方面發(fā)揮了重要作用，許多作用與糖皮質(zhì)激素相似。另外，糖皮質(zhì)激素和TGF-β1激活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路間具有復(fù)雜的相互作用，根據(jù)細(xì)胞類型和調(diào)節(jié)的靶基因不同，GC和TGF-β1往往表現(xiàn)為相互協(xié)同或者相互拮抗的效應(yīng)。例如，已知糖皮質(zhì)激素被臨床廣泛用于治療肺、腎和肝等組織的纖維化。該作用的重要機(jī)制之一是抑制TGF-β的作用。研究表明，GC不僅能抑制組織TGF-β1的分泌，GC/GR還能通過與Smad的直接相互作用抑制TGF-β1的信

6、號轉(zhuǎn)導(dǎo)和靶基因的轉(zhuǎn)錄。而近年來的研究發(fā)現(xiàn)，GC和TGF-β1信號通路之間也具有協(xié)同效應(yīng)。如有報道人工合成的糖皮質(zhì)激素一地塞米松(Dex)和TGF-β1單獨(dú)都能抑制前列腺癌PC-3細(xì)胞的增殖，兩者共同作用時，抑增殖作用更為明顯。我們前期的實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，在人卵巢癌HO-8910細(xì)胞中，Dex和TGFβ1單獨(dú)作用均能增加該細(xì)胞與基質(zhì)的粘附能力，兩者聯(lián)合作用時促進(jìn)粘附的效果明顯大于兩者單獨(dú)作用的效果；對其機(jī)制的研究表明Dex在PC-3細(xì)胞和HO-

7、8910細(xì)胞中都可以上調(diào)TGF-β1的Ⅱ型受體的表達(dá)，并增強(qiáng)TGF-β1的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，表明兩條通路間的確存在相互作用。但是對于兩條通路間協(xié)同作用的很多細(xì)節(jié)以及共同影響的靶基因的表達(dá)，我們至今了解的不多。
　　 在前期研究工作中，我們發(fā)現(xiàn)Dex能夠上調(diào)人卵巢癌HO-8910細(xì)胞RhoB的表達(dá)，RhoB的上調(diào)參與了Dex對HO-8910細(xì)胞的增殖抑制作用，并發(fā)現(xiàn)Dex能明顯抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)其分化，但是RhoB是否參與了Dex

8、對骨肉瘤細(xì)胞的上述作用還不清楚。此外，有研究表明，TGF-β1能夠抑制MG-63等骨細(xì)胞的增殖。新近還有報道TGF-β1在3T3成纖維細(xì)胞和HaCaT角質(zhì)細(xì)胞中能夠上調(diào)RhoB的表達(dá)。因此TGF-β1對MG-63細(xì)胞RhoB的表達(dá)是否有影響，以及RhoB在骨肉瘤細(xì)胞中的作用也是令人感興趣的問題。
　　 本實(shí)驗(yàn)以骨肉瘤細(xì)胞為模型，首先研究了Dex對人成骨肉瘤MG-63和HOS-8603細(xì)胞RhoB的誘導(dǎo)作用，在證實(shí)Dex可以上調(diào)上

9、述細(xì)胞RhoB之后，進(jìn)一步研究了Dex上調(diào)MG-63細(xì)胞RhoB的分子機(jī)制以及RhoB在Dex調(diào)節(jié)MG-63細(xì)胞增殖、分化和粘附中可能的作用。在此基礎(chǔ)上，我們又研究了TGF-β對RhoB表達(dá)的影響及其可能的機(jī)制，以及Dex和TGF-β1聯(lián)合作用對人成骨肉瘤MG-63細(xì)胞RhoB的誘導(dǎo)作用和對MG-63細(xì)胞增殖與粘附的影響。本課題有助于進(jìn)一步闡明RhoB的作用和調(diào)節(jié)機(jī)制，以及糖皮質(zhì)激素和TGF-β對骨細(xì)胞和骨肉瘤細(xì)胞的作用機(jī)制。
　

10、　 一、糖皮質(zhì)激素對人成骨肉瘤細(xì)胞RhoB的誘導(dǎo)作用、機(jī)制及生物學(xué)意義
　　 (一)Dex對人成骨肉瘤細(xì)胞RhoB表達(dá)的影響。
　　 我們選擇MG-63和HOS-8603兩種人成骨肉瘤細(xì)胞作為研究對象，用Real-timePCR和Western Blot方法檢測了Dex對RhoB表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Dex能夠上調(diào)成骨肉瘤細(xì)胞RhoB的表達(dá)。
　　 (二)Dex誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞RhoB表達(dá)的機(jī)制研究。
　

11、　 1.Dex上調(diào)RhoB的表達(dá)通過GR介導(dǎo)；
　　 2.Dex不能誘導(dǎo)含有人RhoB啟動子序列(-1765/+111)的報告基因的表達(dá)；
　　 3.Dex能夠增強(qiáng)RhoB mRNA和蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性；
　　 4.PI-3K/Akt和p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了Dex對RhoB的誘導(dǎo)。
　　 (三)Dex誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞RhoB表達(dá)的生物學(xué)意義。
　　 1.RhoB參與了Dex對MG-63

12、細(xì)胞的增殖抑制作用；
　　 2.RhoB不參與Dex對MG-63細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用；
　　 3.RhoB參與了Dex增強(qiáng)MG-63細(xì)胞粘附活性的作用；
　　 二、TGF-β1對人成骨肉瘤細(xì)胞RhoB的誘導(dǎo)作用、機(jī)制及生物學(xué)意義
　　 (一)TGF-β1對人成骨肉瘤細(xì)胞RhoB表達(dá)的影響。
　　 (二)TGF-β1誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞RhoB表達(dá)的機(jī)制研究。
　　 1.TGF-β1能夠誘導(dǎo)含有

13、人RhoB啟動子序列(r1765/+111)的報告基因的表達(dá)；
　　 2.PI-3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了TGF-β1對RhoB的誘導(dǎo)作用。
　　 (三)TGF-β1抑制MG-63細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)其粘附活性。
　　 三、Dex和TGF-β1聯(lián)用對MG-63細(xì)胞RhoB的誘導(dǎo)作用及生物學(xué)意義
　　 (一)Dex和TGF-β1對MG-63細(xì)胞RhoB的表達(dá)有協(xié)同作用。
　　 (二)Dex和TGF-

14、β1聯(lián)用誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞RhoB的生物學(xué)意義。
　　 1.Dex和TGF-β1聯(lián)用能夠協(xié)同上調(diào)MG-63細(xì)胞的粘附活性；
　　 2.Dex和TGF-β1聯(lián)用對MG-63細(xì)胞增殖的影響。
　　 (三)Dex對MG-63細(xì)胞TGF-β1的分泌沒有影響。
　　 綜上所述，我們獲得以下結(jié)論：
　　 1.Dex能夠通過增強(qiáng)RhoB mRNA和RhoB蛋白的穩(wěn)定性上調(diào)人骨肉瘤MG-63細(xì)胞RhoB的表達(dá)，D

15、ex激活PI-3K/Akt和p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了Dex對RhoB的上調(diào)作用；
　　 2.RhoB參與了Dex對MG-63細(xì)胞的增殖抑制作用和增強(qiáng)細(xì)胞粘附的作用，但對Dex的誘導(dǎo)細(xì)胞分化作用沒有明顯影響；
　　 3.TGF-β1也能在轉(zhuǎn)錄水平上誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞RhoB的表達(dá)；PI-3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活參與了TGF-β1對RhoB的誘導(dǎo)作用；
　　 4.Dex和TGF-β1聯(lián)用能夠協(xié)同上調(diào)M