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文檔簡介
1、第一部分,研究背景:神經(jīng)干細胞作為一種具有自我更新、增殖和可以定向分化為神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞能力的細胞,不僅打破了中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育成熟后不可再生的理論,還為神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復和退行性病變的治療提供了新的思路。對于神經(jīng)干細胞的研究,是以保持體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞具有活躍的增殖能力為基礎的。同時,中樞神經(jīng)系統(tǒng)各種不同的疾病大多是由于表型和功能不同的神經(jīng)元病變所致,然而許多研究表明如果將神經(jīng)干細胞直接移植于受損區(qū),則分化成所需的特異
2、性神經(jīng)元將很少,難以發(fā)揮功能效應。神經(jīng)干細胞的分化是一個復雜的多因素參與的過程,對于膽堿能神經(jīng)元的體外分化條件和機制的研究目前尚未達成共識。 目的:本部分的研究旨在通過對神經(jīng)干細胞的分離培養(yǎng),觀察研究其基本生物學特性,了解其增殖分化和體外培養(yǎng)獲得大量擴增的條件,為進一步研究神經(jīng)干細胞的定向分化奠定基礎。在體外環(huán)境下誘導神經(jīng)干細胞向膽堿能神經(jīng)元分化,探討神經(jīng)干細胞的體外分化條件及誘導分化機制。 方法:將孕齡17d的胚胎大鼠
3、脊髓組織制備成單細胞懸液,接種到限定性無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng),待形成原代克隆球后傳代擴增。對第3代的神經(jīng)干細胞球進行神經(jīng)上皮干細胞蛋白(Nestin)免疫熒光檢測。然后,將神經(jīng)干細胞克隆球接種到內(nèi)置多聚賴氨酸包被的蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中,應用誘導因子RA、SHH、NT-3和BDNF對神經(jīng)干細胞進行誘導分化。在37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中分化兩周后,用免疫熒光檢測膽堿能神經(jīng)元特異性標志物膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)的表達。 結(jié)果:
4、獲得了大量能自我增殖,表達Nestin,并可在體外長期維持穩(wěn)定狀態(tài)的神經(jīng)干細胞。神經(jīng)干細胞經(jīng)誘導因子誘導1 w后,可見分化的細胞呈典型的神經(jīng)元樣細胞形態(tài):胞體飽滿而不規(guī)則,有多個細長突起;誘導2 w后,神經(jīng)細胞之間形成了網(wǎng)絡狀結(jié)構(gòu),免疫熒光檢測,ChAT陽性率達20%。 結(jié)論:從大鼠胚胎脊髓組織中分離得到的細胞具有不斷增殖和自我更新能力,并具有分化為神經(jīng)元的潛能。SHH、 RA、NT-3和BDNF的共誘導可以誘導脊髓源性神經(jīng)干細
5、胞在體外分化為膽堿能神經(jīng)元。 第二部分,研究背景:神經(jīng)干細胞的生長和發(fā)育過程的調(diào)控涉及多個方面,包括神經(jīng)細胞特性的決定、細胞數(shù)量的控制,細胞分化的格局化和空間控制等。眾多基因家族參與了該過程,其中bHLH家族的Hes1和Mash1基因,作為神經(jīng)發(fā)育的相關基因,廣泛表達于發(fā)育中的中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)。Hes基因?qū)儆谪撜{(diào)控型的bHLH轉(zhuǎn)錄因子,在維持神經(jīng)干細胞增殖,使大腦細胞具有正確的數(shù)目、形態(tài)和細胞排列等方面具有重要的作用。正調(diào)控型
6、轉(zhuǎn)錄因子Mash1基因,則有促進神經(jīng)前體細胞向神經(jīng)元分化作用。正調(diào)控型和負調(diào)控型bHLH轉(zhuǎn)錄因子之間的彼此調(diào)控,共同調(diào)控著神經(jīng)干細胞的分化并且決定著其分化方向。本實驗通過體外誘導神經(jīng)干細胞向膽堿能神經(jīng)元分化,觀察Hes1和Mash1基因的表達變化,了解它們在神經(jīng)干細胞定向分化為膽堿能神經(jīng)元過程中發(fā)揮的作用。 目的:通過檢測胚胎大鼠脊髓源性神經(jīng)干細胞定向誘導分化為膽堿能神經(jīng)元過程中Hes1和Mash1基因的表達變化,探討神經(jīng)干細胞
7、的定向分化機制。 方法:取體外培養(yǎng)的第三代的神經(jīng)干細胞,接種于多聚賴氨酸包被過的6孔培養(yǎng)板中,通過在培養(yǎng)基中添加誘導因子RA、SHH、NT-3和BDNF,誘導其向膽堿能神經(jīng)元分化。應用實時定量PCR技術分析神經(jīng)干細胞及向膽堿能神經(jīng)元誘導分化1 w和2 w時,Hes1、Mash1和Nestin基因的表達變化。 結(jié)果:Hes1、Mash1和Nestin mRNA在神經(jīng)干細胞分化前后表達有變化,誘導1w時各基因均較對照組表達下
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