HLA-G表達(dá)與荷瘤小鼠卵巢癌轉(zhuǎn)移關(guān)系研究.pdf

1、目的:
　　 本研究旨在通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究HLA-G對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力及對(duì)荷瘤小鼠生存時(shí)間的影響，探討HLA-G在卵巢癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮的作用。
　　 方法:
　　 1.HLA-G真核表達(dá)載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)染及鑒定將HLA-G全長(zhǎng)基因連接到真核表達(dá)載體pVITRO2-mcs上，經(jīng)限制內(nèi)切酶雙酶切及測(cè)序鑒定質(zhì)粒構(gòu)建正確性。將HLA-G/pVITRO2-mcs及陰性對(duì)照pVITRO2-mcs轉(zhuǎn)染到人卵巢癌細(xì)胞株HO-

2、8910和Ovcar-3，分別經(jīng)轉(zhuǎn)錄水平及翻譯水平鑒定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中HLA-G表達(dá)情況。
　　 2.transwell細(xì)胞培養(yǎng)及3D細(xì)胞培養(yǎng)采用transwell細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)檢測(cè)人卵巢癌細(xì)胞株HO-8910和Ovcar-3轉(zhuǎn)染HLA-G基因前后，細(xì)胞遷移及侵襲能力變化。同時(shí)，采用3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)觀察人卵巢癌細(xì)胞株HO-8910轉(zhuǎn)染HLA-G基因前后，細(xì)胞形成多細(xì)胞球體的三維結(jié)構(gòu)情況。
　　 3.動(dòng)物體內(nèi)研究分別將人卵巢癌細(xì)胞

3、HO-8910、HO-8910-G、Ovcar-3、Ovcar-3-G及對(duì)照PBS種植到荷瘤小鼠體內(nèi)，觀察裸鼠生長(zhǎng)情況及體表瘤體情況，記錄荷瘤小鼠體表腫塊大小及死亡時(shí)間;對(duì)荷瘤小鼠各個(gè)臟器進(jìn)行組織病理學(xué)分析，觀察組織形態(tài)學(xué)改變及癌轉(zhuǎn)移情況;采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)荷瘤小鼠臟器組織HLA-G的表達(dá)情況;此外，采用Kaplan-Meier分析方法對(duì)荷瘤小鼠進(jìn)行生存分析。
　　 結(jié)果:
　　 1.HLA-G真核表達(dá)載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)

4、染及鑒定經(jīng)限制性內(nèi)切酶雙酶切及測(cè)序證實(shí)HLA-G/pVITRO2-mcs構(gòu)建成功，經(jīng)RT-PCR、western blot及流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)HLA-G轉(zhuǎn)染人卵巢癌細(xì)胞株HO-8910和Ovcar-3成功。
　　 2.transwell細(xì)胞培養(yǎng)及3D細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)transwell細(xì)胞體外培養(yǎng)，結(jié)果顯示，HO-8910和HO-8910-G細(xì)胞體外遷移能力具有顯著差異(p=0.02)。在上室底部加入Matrigel，凝固后進(jìn)行transw

5、ell細(xì)胞培養(yǎng)，結(jié)果顯示，HO-8910和HO-8910-G、Ovcar-3和Ovcar-3-G細(xì)胞體外侵襲能力均具有顯著的差異(p＜0.001)。采用3D細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果表明HO-8910-G細(xì)胞呈現(xiàn)一種多細(xì)胞球體的三維結(jié)構(gòu)，這種構(gòu)象更加有利于細(xì)胞的侵襲，而HO-8910細(xì)胞則不呈現(xiàn)這種多細(xì)胞球體的三維結(jié)構(gòu)。
　　 3.動(dòng)物體內(nèi)研究分別將HO-8910、HO-8910-G、Ovcar-3、Ovcar-3-G細(xì)胞接種到荷瘤小鼠，組織

6、病理學(xué)分析顯示，HO-8910-G和Ovcar-3-G接種裸鼠體內(nèi)的腫瘤具有更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力，在肌肉、肺、心臟、腎臟均發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移灶。而HO-8910和Ovcar-3組未發(fā)現(xiàn)明顯的腫瘤轉(zhuǎn)移。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果表明，HLA-G表達(dá)在種植了HO-8910-G和Ovcar-3-G裸鼠的腫瘤原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶上，而HO-8910和Ovcar-3組均未表達(dá)HLA-G分子。此外，HO-8910-G接種的裸鼠，其中位數(shù)生存時(shí)間為48天(95％ CI:3

7、8.4-57.6)，明顯比HO-8910組（93天，95％ CI:82.2-103.8）縮短(p=0.001)。Ovcar-3-G接種的裸鼠，其中位數(shù)生存時(shí)間為57天(95％ CI:46.2-67.8)，明顯比Ovcar-3組（82天，95％ CI:736.-90.4）縮短(p=0.002)。HO-8910組與HO-8910-G組、Ovcar-3組與Ovcar-3-G組裸鼠的生存時(shí)間均存在顯著性差異(p＜0.01)。
　　 結(jié)論