異種同源EGFR胞外段在畢赤巴斯德酵母中的表達及其抗腫瘤作用的實驗研究.pdf

1、目的表皮生長因子受體(EGFR)是CerbB1/EGFR基因編碼的Src家族跨膜受體酪氨酸激酶，由胞外段，跨膜段及胞內激酶活性段構成。其胞外段的主要功能是結合表皮生長因子EGF等配體介導受體同源二聚化，或者與同族其它的受體如erbB2等異二聚化，進而激活胞內段酪氨酸激酶活性，啟動EGFR通路信號傳遞。目前EGFR胞外段已成為EGFR陽性表達的腫瘤免疫治療的重要標靶。本實驗通過分子克隆技術實現異種同源表皮生長因子受體EGFR胞外段在畢赤巴

2、斯德酵母中的分泌性表達，并通過基因工程純化得到異種同源的重組EGFR蛋白疫苗，對家兔和荷瘤小鼠進行免疫，探討以EGFR為靶向激發(fā)EGFR特異的抗腫瘤主動免疫反應的可行性。方法將鼠和人的EGFR胞外段目的基因(mer，her)與分泌型畢赤酵母表達載體pPICZαA重組，構建了相應的重組表達質粒pPICZαA-mer和pPICZαA-her，用SacI將重組質粒線性化后，電穿孔轉化酵母菌株GS115，利用Zeocin篩選陽性克隆，挑出陽性克

3、隆用甲醇小規(guī)模誘導表達后，進行SDS-PAGE分析及Western-blot檢測，篩選高表達量的克隆作大規(guī)模誘導表達。分離純化得到重組蛋白EGFR，并用SDS-PAGE分析及Western-blot鑒定。在C57BL/6小鼠皮下注射腫瘤細胞hepal-6，建立小鼠肝癌模型，用重組蛋白EGFR與復方氫氧化鋁佐劑的混合物作為蛋白疫苗對荷瘤小鼠進行免疫治療。并用重組蛋白mEGFR與復方氫氧化鋁佐劑的混合物免疫家兔，以制備大量兔抗鼠的抗體，為后

4、續(xù)裸鼠實驗打基礎。結果獲得了鼠和人的EGFR胞外段目的蛋白在畢赤巴斯德酵母中的分泌性表達，SDS-PAGE分析及Western-blot檢測得到預期條帶，相對分子質量約為95×103。免疫印跡分析表明，表達蛋白具有良好的抗原性和特異性。在建立的小鼠肝癌模型中用該重組蛋白作為疫苗進行免疫，接種腫瘤細胞3天后開始注射疫苗，每周1次，共4次，可見到一定的腫瘤抑制效應。獲得高滴度的兔抗鼠的抗體，體外A431細胞抑制實驗顯示抗體有良好抑制效應。結