人中腦星型膠質(zhì)來(lái)源的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子MANF基因啟動(dòng)子區(qū)域的克隆及功能研究.pdf

1、MANF(Mesenceph alicastrocyte-derived neurotrophie factor)基因又名ARP(arginine rich protein)或Aremt(Arginine-Rich,Mutatedin Earlystageof Tumors)。最初被鑒定是一個(gè)在不同的腫瘤組織中高度突變的基因,其編碼的蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmicreticulum,ER)、高爾基體(Golgiapparatu

2、s)。2003年有學(xué)者在大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞株培養(yǎng)上清液中分離純化得到MANF蛋白,并且發(fā)現(xiàn)該蛋白具有促神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)作用,因此又被命名為中腦星形膠質(zhì)來(lái)源的促神經(jīng)生成因子。該蛋白的分子量是20kD,并且是一種分泌性蛋白質(zhì)。后來(lái)證明,MANF基因在ER應(yīng)激反應(yīng)時(shí)特異性高表達(dá),在腦缺血、帕金森氏病等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中對(duì)神經(jīng)元發(fā)揮較好的保護(hù)作用。MANF蛋白可以保護(hù)細(xì)胞避免ER應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。在最近的研究中,我們發(fā)現(xiàn)MANF基因在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎

3、,SLE等自身免疫系統(tǒng)疾病的炎癥病灶和炎癥細(xì)胞中有特異性的高表達(dá)。然而,MANF基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制及蛋白質(zhì)功能目前尚未深入研究。
　　本研究的目的主要集中對(duì)人MANF基因啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行分析,在轉(zhuǎn)錄水平上,研究人MANF基因上游啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制,分析MANF基因在ER應(yīng)激和炎癥通路中表達(dá)上調(diào)的機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn),MANF啟動(dòng)子受多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控,其中最主要的轉(zhuǎn)錄因子X(jué)BP1、SP1和AP1有正向調(diào)控作用。本論文主要研究?jī)?nèi)

4、容及結(jié)果如下:
　　(1)通過(guò)對(duì)人MANF基因的5’端非翻譯區(qū)pEGFP-1-MANF-5F和pGL3-MANF-5F質(zhì)粒的構(gòu)建,利用倒置顯微鏡下觀察綠色熒光以及體外雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)的結(jié)果分析,我們確定了克隆人MANF基因5’端序列具有啟動(dòng)子活性;
　　(2)ER應(yīng)激誘導(dǎo)劑tunicamycin(TM)刺激細(xì)胞,體外雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果分析,我們觀察到ER應(yīng)激可以明顯上調(diào)人MANF基因啟動(dòng)子活性;
　　(3)運(yùn)

5、用TESS在線生物學(xué)軟件對(duì)人MANF基因的序列進(jìn)行分析,結(jié)果顯示此啟動(dòng)子區(qū)域主要存在轉(zhuǎn)錄因子X(jué)BP1、SP1和AP1的結(jié)合位點(diǎn);
　　(4)在N2A細(xì)胞中過(guò)表達(dá)XBP1、SP1和AP1,體外雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)初步證實(shí)各轉(zhuǎn)錄因子X(jué)BP1、SP1和AP1對(duì)人MANF基因啟動(dòng)子區(qū)的調(diào)節(jié)作用;
　　(5)通過(guò)進(jìn)行截短質(zhì)粒和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子X(jué)BP1、SP1和AP1正向調(diào)節(jié)MANF基因啟動(dòng)子活性;