人中腦星型膠質來源的神經營養(yǎng)因子MANF基因啟動子區(qū)域的克隆及功能研究.pdf

1、MANF(Mesenceph alicastrocyte-derived neurotrophie factor)基因又名ARP(arginine rich protein)或Aremt(Arginine-Rich,Mutatedin Earlystageof Tumors)。最初被鑒定是一個在不同的腫瘤組織中高度突變的基因,其編碼的蛋白定位于內質網(endoplasmicreticulum,ER)、高爾基體(Golgiapparatu

2、s)。2003年有學者在大鼠星形膠質細胞株培養(yǎng)上清液中分離純化得到MANF蛋白,并且發(fā)現該蛋白具有促神經細胞生長作用,因此又被命名為中腦星形膠質來源的促神經生成因子。該蛋白的分子量是20kD,并且是一種分泌性蛋白質。后來證明,MANF基因在ER應激反應時特異性高表達,在腦缺血、帕金森氏病等多種神經系統(tǒng)疾病中對神經元發(fā)揮較好的保護作用。MANF蛋白可以保護細胞避免ER應激誘導的細胞凋亡。在最近的研究中,我們發(fā)現MANF基因在類風濕性關節(jié)炎

3、,SLE等自身免疫系統(tǒng)疾病的炎癥病灶和炎癥細胞中有特異性的高表達。然而,MANF基因的轉錄調控機制及蛋白質功能目前尚未深入研究。
　　本研究的目的主要集中對人MANF基因啟動子的結構和功能進行分析,在轉錄水平上,研究人MANF基因上游啟動子區(qū)域的轉錄調控機制,分析MANF基因在ER應激和炎癥通路中表達上調的機制。結果發(fā)現,MANF啟動子受多個轉錄因子調控,其中最主要的轉錄因子XBP1、SP1和AP1有正向調控作用。本論文主要研究內

4、容及結果如下:
　　(1)通過對人MANF基因的5’端非翻譯區(qū)pEGFP-1-MANF-5F和pGL3-MANF-5F質粒的構建,利用倒置顯微鏡下觀察綠色熒光以及體外雙熒光素酶報告基因實驗的結果分析,我們確定了克隆人MANF基因5’端序列具有啟動子活性;
　　(2)ER應激誘導劑tunicamycin(TM)刺激細胞,體外雙熒光素酶報告基因結果分析,我們觀察到ER應激可以明顯上調人MANF基因啟動子活性;
　　(3)運

5、用TESS在線生物學軟件對人MANF基因的序列進行分析,結果顯示此啟動子區(qū)域主要存在轉錄因子XBP1、SP1和AP1的結合位點;
　　(4)在N2A細胞中過表達XBP1、SP1和AP1,體外雙熒光素酶報告基因實驗初步證實各轉錄因子XBP1、SP1和AP1對人MANF基因啟動子區(qū)的調節(jié)作用;
　　(5)通過進行截短質粒和轉錄因子結合位點定點突變實驗,進一步發(fā)現轉錄因子XBP1、SP1和AP1正向調節(jié)MANF基因啟動子活性;