胎盤(pán)組織源單個(gè)核細(xì)胞免疫活性的研究.pdf

1、研究目的；近年來(lái),造血干細(xì)胞移植成為治療惡性血液病、再生障礙性貧血、自身免疫性疾病,某些遺傳性疾病及實(shí)體瘤的一種重要手段.據(jù)有關(guān)資料顯示,僅我國(guó)就有400多萬(wàn)各類(lèi)疾病患者等待造血干細(xì)胞移植,而造血干細(xì)胞的來(lái)源卻很有限.骨髓、外周血和臍血是目前造血干細(xì)胞的主要來(lái)源,骨髓和外周血造血干細(xì)胞移植要求HLA配型完全一致,這即使是同胞間也只有25﹪的機(jī)率,在非血緣關(guān)系的人群中僅有1/400-1/10000的可能性,遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床治療的需要;臍血

2、雖免疫原性較弱,移植后移植物抗宿主病(GVHD)的發(fā)生率低,但單份臍血中所含的造血干細(xì)胞數(shù)量有限,難以使一個(gè)成人獲得造血干細(xì)胞重建,需要擴(kuò)增后才能用于成人.所以尋找新的造血干細(xì)胞來(lái)源是個(gè)極待解決的問(wèn)題.已有研究證實(shí):胎盤(pán)中含有較多的造血干細(xì)胞,胎盤(pán)組織有支持造血干細(xì)胞生存的微環(huán)境.這表明通常丟棄的胎盤(pán)也有望成為HSC移植的資源.但胎盤(pán)組織中造血干細(xì)胞的含量有限,故胎盤(pán)造血干細(xì)胞進(jìn)行體外擴(kuò)增成為胎盤(pán)造血干細(xì)胞用于移植的一個(gè)前提,國(guó)內(nèi)外已有

3、相關(guān)報(bào)道.移植治療后GVHD是影響移植治療效果的重要原因之一,本研究比較了擴(kuò)增后的胎盤(pán)及臍血單個(gè)核細(xì)胞和動(dòng)員后的外周血的免疫活性,以了解胎盤(pán)作為干細(xì)胞源用于移植時(shí)GVHD的發(fā)生情況,為胎盤(pán)組織源造血干細(xì)胞用于移植提供理論依據(jù). 對(duì)象與方法；(一)對(duì)象 1.胎盤(pán)組織和與其相對(duì)應(yīng)的臍血8份:在無(wú)菌條件下,分別采集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院足月健康順產(chǎn)分娩孕婦的胎盤(pán)及與其相對(duì)應(yīng)的臍血. 2.外周血8份:在無(wú)菌條件下采集鄭州大學(xué)第一附

4、屬醫(yī)院和河南省腫瘤醫(yī)院血液科干細(xì)胞移植健康供者的經(jīng)G-CSF動(dòng)員4-5后的外周血. (二)方法 1.單個(gè)核細(xì)胞(MNC)制備:剪切胎盤(pán)組織呈1-2mm<'3>大小的組織塊,用酶消化的方法經(jīng)320目的細(xì)胞篩過(guò)濾制備胎盤(pán)組織源單個(gè)細(xì)胞懸液;用淋巴細(xì)胞分離液分別分離胎盤(pán)組織源、臍血源的MNC. 2.胎盤(pán)和臍血MNC的體外培養(yǎng):將分離的胎盤(pán)MNC、臍血MNC用DMEM培養(yǎng)液懸浮,加入刺激因子,置37℃、體積濃度為5﹪CO

5、<,2>、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天. 3.用淋巴細(xì)胞分離液將培養(yǎng)后的胎盤(pán)和臍血細(xì)胞再次分離MNC,同時(shí)分離動(dòng)員后的外周血的MNC,并為后續(xù)實(shí)驗(yàn)調(diào)好細(xì)胞濃度. 4.采用CCK-8檢測(cè)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中胎盤(pán)、臍血和外周血三種來(lái)源細(xì)胞的增殖情況;采用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)胎盤(pán)、臍血和外周血三種來(lái)源細(xì)胞中CD<,3>、CD<,19>、CD<,16>、CD<,56>、HLA-DR的表達(dá). 結(jié)果 1.單向混合淋巴細(xì)胞反

6、應(yīng)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中,擴(kuò)增后的胎盤(pán)MNC組的細(xì)胞增殖顯著低于其他兩組(P<0.001),擴(kuò)增后的臍血MNC組的細(xì)胞增殖顯著高于擴(kuò)增后的胎盤(pán)MNC,但卻顯著低于動(dòng)員后的外周血(P<0.001). 2.表型分析擴(kuò)增后的胎盤(pán)MNC中T淋巴細(xì)胞(CD<,3><'+>細(xì)胞)、B淋巴細(xì)胞(CD<,19><'+>細(xì)胞) 比例少于擴(kuò)增后的臍血MNC和動(dòng)員后的外周血,與擴(kuò)增后臍血MNC和動(dòng)員后的外周血均有顯著差異.擴(kuò)增后的胎盤(pán)MNC中NK細(xì)胞(C

7、D<,16><'+>CD<,56><'+>細(xì)胞)和HLA-DR+細(xì)胞比例最高,與擴(kuò)增后臍血MNC和動(dòng)員后的外周血有顯著差異;臍血中NK細(xì)胞的含量最少. 結(jié)論 1.單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中,以擴(kuò)增后的胎盤(pán)MNC組的細(xì)胞增殖最低,表明擴(kuò)增后的胎盤(pán)MNC免疫活性最低. 2.擴(kuò)增后的胎盤(pán)MNC中CD<,3><'+>細(xì)胞,CD<,19><'+>細(xì)胞的比例最低,表明擴(kuò)增后的胎盤(pán)MNC免疫活性最低. 3.擴(kuò)增后的胎盤(pán)MN