莪術潰堅方對胰腺癌抑瘤作用及其機理研究.pdf

1、第一部分DcR3在人胰腺癌中的表達及其與臨床病理參數(shù)間關系
　　目的：研究胰腺癌中DcR3的蛋白表達與臨床病理參數(shù)間關系。
　　方法：通過免疫組織化學(IHC)檢測人胰腺癌組織芯片中DcR3蛋白的表達，91例胰腺癌組織，5例正常胰腺組織，比較其表達差異，并在胰腺癌癌組織中分析其表達與主要臨床參數(shù)相關性。
　　結果： DcR3蛋白在細胞內主要分布于胞漿中，在胰腺癌中DcR3蛋白陽性表達率明顯高于正常胰腺組織，且DcR3陽

2、性表達與腫瘤TNN分期相關。分期越晚，其表達越高。
　　結論:胰腺癌組織中存在DcR3基因的過表達，DcR3的表達與腫瘤TNM分期相關。
　　第二部分莪術潰堅方對胰腺癌MiaPaCa-2裸鼠移植瘤的抑瘤作用研究
　　目的：在動物體內觀察莪術潰堅方對人胰腺癌的抑瘤作用，為莪術潰堅方應用于臨床治療胰腺癌，改善預后提供一定的理論依據(jù)。
　　方法：利用Real time PCR篩選出高表達DcR3的胰腺癌細胞系MiaPa

3、Ca-2，建立人胰腺癌裸鼠皮下移植瘤，分成模型組、卡培他濱組、莪術潰堅方低劑量組(10g/Kg)和莪術潰堅方高劑量組(20g/Kg)干預治療，觀察腫瘤生長情況，比較不同組間抑瘤率，通過Western blot方法檢測不同組裸鼠腫瘤的DcR3蛋白的表達。
　　結果：DcR3在四種人胰腺癌細胞中均有表達，其中AsPC-1、MiaPaca-2和BxPC3細胞中DcR3表達量是PANC-1細胞的0.8，8.5和3.2倍;成功建立了MiaP

4、aCa-2胰腺癌荷瘤裸鼠模型，與模型組相比，卡培他濱組、莪術潰堅方低劑量組(10g/Kg)及莪術潰堅方高劑量(20g/Kg)對MiaPaCa-2體內生長有一定抑制作用，卡培他濱組、莪術潰堅方低劑量組(10g/Kg)及莪術潰堅方高劑量(20g/Kg)的腫瘤體積在造模后第3周、第4周時明顯小于模型組（P＜0.05）。卡培他濱組、莪術潰堅方低劑量組(10g/Kg)及莪術潰堅方高劑量(20g/Kg)的腫瘤體積在造模后第1-4周無明顯差別（P＞0

5、.05）;與模型組相比，卡培他濱組的DcR3蛋白相對表達量無明顯差異（P＞0.05），莪術潰堅方低劑量組組(10g/Kg)及莪術潰堅方高劑量組(20g/Kg)均明顯低于模型組（P＜0.05)。
　　結論：莪術潰堅方可以通過抑制移植瘤內的DcR3的表達，抑制腫瘤生長，達到治療作用。低劑量莪術潰堅方和高劑量莪術潰堅方抑瘤率無明顯差別。
　　第三部分莪術潰堅方下調DcR3抑制人胰腺癌細胞的生長
　　目的:研究莪術潰堅方對人胰

6、腺癌細胞生長、增殖、遷移、侵襲和凋亡影響和可能機制。
　　方法：通過MTT法檢測莪術潰堅方單藥中主要單體莪術醇、呋喃二烯、吉馬酮、苦杏仁苷、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d對Miapaca-2、BxPC-3對人胰腺癌細胞體外增殖影響，并繪制細胞增殖曲線;選取抑制腫瘤細胞最明顯的柴胡皂苷a和柴胡皂苷d，通過劃痕實驗、體外侵襲實驗、AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色法檢測其對MiaPaCa-2細胞侵襲、凋亡的影響;體外設計針對DcR3基因的

7、siRNA1、siRNA2、siRNA3和contol siRNA，采用脂質體轉染方法將siRNA導入人胰腺癌細胞系miapaca-2，通過Western blot方法對細胞RNAi后DcR3表達情況進行鑒定，測定經(jīng)DcR3的RNAi后，柴胡皂苷a和d對凋亡敏感性影響。Western blot檢測檢測加入柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、U0126（ERK1/2抑制劑）后DcR3表達，以及MAPK信號通路下游反應性靶基因ERK1/2及p-ERK1

8、/2。
　　結果：莪術潰堅方中單體莪術醇、呋喃二烯、吉馬酮、苦杏仁苷對人胰腺癌細胞系MiaPaca-2和BxPC3有生長抑制作用不明顯;柴胡皂苷a和柴胡皂苷d對人胰腺癌細胞系MiaPaca-2和BxPC3有明顯生長抑制作用(P＜0.05)，其抗腫瘤作用呈時間及劑量依賴性，用藥72h后效應明顯;在柴胡皂苷a或柴胡皂苷d作用24h后，MiaPaCa-2細胞體外運動能力都明顯減弱。與未做任何處理的MiaPaCa-2細胞相比，經(jīng)柴胡皂苷a

9、作用24h后，傷口面積降低了61.2％(P＜0.05);經(jīng)柴胡皂苷d作用24h后，傷口面積降低了47.3％(P＜0.05)。在柴胡皂苷a或柴胡皂苷d作用48h后，MiaPaCa-2細胞體外侵襲能力明顯減弱，經(jīng)柴胡皂苷a作用48小時后，侵襲細胞減少了26.5(P＜0.05);經(jīng)柴胡皂苷d作用48小時后，侵襲細胞數(shù)減少了31.2％(P＜0.05)。柴胡皂苷a體外給藥24h，可導致MiaPaCa-2胰腺癌細胞凋亡顯著增加;柴胡皂苷d體外給藥2

10、4h，可導致MiaPaCa-2胰腺癌細胞凋亡顯著增加;經(jīng)DcR3 RNAi后，可明顯增加對柴胡皂苷a、柴胡皂苷a對誘導MiaPaCa-2胰腺癌細胞凋亡能力。經(jīng)柴胡皂苷a、柴胡皂苷d和U0126（20um）作用48小時后，MiaPaCa-2細胞DcR3蛋白表達水平明顯降低，ERK1/2蛋白無明顯變化，p-ERK1/2表達隨之降低。
　　結論:莪術潰堅方中柴胡皂苷a、d對胰腺腫瘤抑瘤效果明顯，且隨時間、劑量關系成正比，進一步實驗表明了