m3受體對(duì)撤血清誘導(dǎo)的CHO細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo).pdf

1、該次試驗(yàn)將攜帶毒蕈堿受體m3亞型的基因轉(zhuǎn)染到CHO-K1細(xì)胞中,建立穩(wěn)定表達(dá)的含有單一毒蕈堿受體m3受體亞型的細(xì)胞系,并采用撤血清誘導(dǎo)CHO細(xì)胞凋亡模型.研究激動(dòng)m3受體對(duì)凋亡的細(xì)胞作用并探討與此相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,采用m3單克隆抗體探討不同條件下CHO細(xì)胞中m3受體表達(dá)情況.方法:1、采用脂質(zhì)體包裹的方法將攜帶有毒蕈堿受體m3亞型基因的PCDNA的質(zhì)粒經(jīng)擴(kuò)增純化后,轉(zhuǎn)染至CHO-K1細(xì)胞內(nèi),建立穩(wěn)定表達(dá)單一毒蕈堿受體m3受體亞型的細(xì)胞

2、系.2、采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)和Western-blotting檢測(cè)CHO細(xì)胞表面毒蕈堿受體m3受體亞型的表達(dá).3、應(yīng)用撤血清的方法誘導(dǎo)含有毒蕈堿受體m3受體亞型的CHO細(xì)胞凋亡,凋亡指標(biāo)包括MTT觀察細(xì)胞存活率、Hoechst33258觀察細(xì)胞核、FDA觀察細(xì)胞形態(tài)的改變,DNAladder分析DNA降解.4、觀察毒蕈堿受

3、體激動(dòng)藥氨甲酰膽堿及其阻斷劑阿托品對(duì)細(xì)胞凋亡的影響.5、RT-PCR檢測(cè)m3受體轉(zhuǎn)錄水平在撤血清誘導(dǎo)的CHO-m3細(xì)胞凋亡過程中的動(dòng)態(tài)變化.6、Western blottingting檢測(cè)在撤血清誘導(dǎo)的CHO-m3細(xì)胞凋亡過程中m3受體表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化.7、Western blottingting研究細(xì)胞內(nèi)c-jun、ERK1/2的磷酸化水平的改變.結(jié)論:1、將攜帶有毒蕈堿受體m3受體亞型的cDNA的質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞,獲得穩(wěn)定的表