Hedgehog信號(hào)通路和EMT相關(guān)因子在黑色素瘤細(xì)胞中表達(dá)及其意義.pdf

1、目的:
　　研究Hedgehog（Hh）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)因子和上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）相關(guān)因子在B16黑色素瘤細(xì)胞中的表達(dá)及兩者交互調(diào)節(jié)關(guān)系。
　　方法:
　　本研究用Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑-環(huán)巴胺（Cyclopamine）處理小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞，采用MTT法與軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞抑制率和克隆形成能力，用RT-PCR法和Wester

2、n-Blot方法檢測(cè) Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和EMT相關(guān)因子的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　MTT結(jié)果顯示：cyclopamine對(duì)B16細(xì)胞有抑制作用，且具有濃度依賴性。軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Cyclopamine藥物組對(duì)細(xì)胞的抑制率有明顯的影響，且隨著藥物濃度的增加對(duì)細(xì)胞的抑制率增高。20μM組與0、2.5、5μM組相比，有顯著性差異（p<0.05）,40、80μM組與20μM組比較，有顯著性差異（p<0.0

3、5）。但是，40μM與80μM組相比，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.109）。
　　軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：B16黑色素瘤細(xì)胞在20μM Cyclopamine藥物組和10μM Cyclopamine藥物組軟瓊脂中所形成的集落個(gè)數(shù)少于對(duì)照組軟瓊脂中的集落個(gè)數(shù)與5μM Cyclopamine藥物組，且具有顯著性差異(p<0.05)；而在5μM Cyclopamine藥物組軟瓊脂中所形成的集落個(gè)數(shù)與對(duì)照組軟瓊脂中的集落個(gè)數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(

4、p>0.05)。且隨著藥物濃度的增高，B16黑色素瘤細(xì)胞所形成的集落個(gè)數(shù)降低。
　　RT-PCR24h結(jié)果顯示：ihh mRNA在給予20μM cyclopamine藥物組和5μM cyclopamine藥物組的表達(dá)低于對(duì)照組。ptch mRNA在各藥物組中的表達(dá)低于在對(duì)照組中的表達(dá)，而在20μM cyclopamine藥物組的表達(dá)低于5μM cyclopamine藥物組。twist mRNA在各藥物組的表達(dá)低于對(duì)照組。vimen

5、tin mRNA在給予5μM cyclopamine藥物組的表達(dá)高于20μM cyclopamine藥物組。slug mRNA在各藥物組表達(dá)低于對(duì)照組。e-cadherin mRNA在5μM cyclopamine藥物組中的表達(dá)低于對(duì)照組，在20μM cyclopamine藥物組中明顯低于對(duì)照組的表達(dá)。48h結(jié)果顯示：ihh mRNA在給予cyclopamine藥物組中的表達(dá)低于對(duì)照組。smo mRNA在20μM cyclopamine

6、藥物組的表達(dá)高于5μM cyclopamine藥物組和對(duì)照組。gli1 mRNA在20μM cyclopamine藥物組中的表達(dá)低于其他藥物組和對(duì)照組。vimentin mRNA在20μM cyclopamine藥物組的表達(dá)高于其他藥物組和對(duì)照組。slug mRNA在20μM cyclopamine的藥物組中的表達(dá)高于其他藥物組和對(duì)照組。e-cadherin mRNA在20μM cyclopamine藥物組的表達(dá)高于5μM cyclop

7、amine藥物組和對(duì)照組。72h結(jié)果顯示：ihh mRNA在cyclopamine各藥物組中的表達(dá)均低于對(duì)照組。ptch mRNA在cyclopamine藥物組的表達(dá)低于對(duì)照組，且20μM cyclopamine的藥物組中的表達(dá)低于5μM cyclopamine藥物組。smo mRNA在20μM cyclopamine藥物組中和5μM cyclopamine藥物組的表達(dá)低于對(duì)照組。vimentin mRNA在20μM cyclopami

8、ne的藥物組中的表達(dá)低于5μM cyclopamine藥物組和對(duì)照組。slug在20μM cyclopamine藥物組中的表達(dá)低于對(duì)照組。
　　Western-Blot24h結(jié)果顯示：gli1蛋白在各組之間無(wú)顯著性差異。48h結(jié)果顯示gli1蛋白在對(duì)照組中的表達(dá)高于20μM cyclopamine藥物組和5μM cyclopamine藥物組。
　　結(jié)論:
　　1. Cyclopamine對(duì)黑色素瘤B16細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯

9、抑制作用。
　　2. gli1在中期（48h）的蛋白和mRNA的表達(dá)均明顯下降。提示Cyclopamine抑制Hedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的第二信使作用。
　　3. Cyclopamine早期(24h)對(duì)黑色素瘤B16細(xì)胞ihh與ptch的表達(dá)有明顯抑制作用，進(jìn)而抑制 Hedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。其作用機(jī)制主要是通過(guò)抑制Hedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的信號(hào)啟動(dòng)環(huán)節(jié)與信號(hào)接收環(huán)節(jié)的終止來(lái)發(fā)生。
　　4. Cyclopam