POLH、POLI、POLK啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位的生物信息學(xué)分析及其重組質(zhì)粒的構(gòu)建.pdf

1、烷化劑尤其是N-亞硝基類烷化劑廣泛存在于環(huán)境中，引起DNA烷基化。其中單功能烷化劑N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)是最常用于研究的化學(xué)誘變劑和致癌劑，它能和DNA及蛋白質(zhì)等生物大分子形成加合物(adduct)，這些加合物最終可導(dǎo)致染色體異常，點(diǎn)突變和細(xì)胞死亡。其引起的與突變有關(guān)的主要DNA損傷類型是O6-甲基鳥嘌呤，這種損傷與腫瘤尤其是胃癌的發(fā)生密切相關(guān)。 為了研究POLH,POLI,POLK的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，研究可

2、能參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子激活狀態(tài)，我們采取生物信息學(xué)方法對三種聚合酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)進(jìn)行預(yù)測。通過多種在線軟件如PromoterInspecter、PromoterScan、Promoter2.0等獲取可能的啟動(dòng)子區(qū)，進(jìn)一步地，我們利用進(jìn)化足跡法及在線軟件Match1.0預(yù)測啟動(dòng)子區(qū)上的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位；應(yīng)用PCR技術(shù)從基因組DNA擴(kuò)增預(yù)測獲得的啟動(dòng)子區(qū)，擴(kuò)增片段經(jīng)分子生物學(xué)技術(shù)連接入報(bào)告基因載體pSeap-Basic。計(jì)劃在隨后的工作中轉(zhuǎn)

3、染FL細(xì)胞，細(xì)胞經(jīng)低濃度MNNG處理后，通過觀察細(xì)胞培養(yǎng)液中分泌型熒光蛋白的濃度，確定這些基因啟動(dòng)子區(qū)經(jīng)MNNG作用的反應(yīng)情況。 一、利用生物信息學(xué)方法預(yù)測POLH,POLLPOLK的啟動(dòng)子區(qū)及其的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位 在這里，我們采用進(jìn)化足跡法首先對所獲得的保守序列進(jìn)行啟動(dòng)子區(qū)的預(yù)測，進(jìn)而進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位的生物信息學(xué)預(yù)測，以期用計(jì)算機(jī)輔助的方法先獲取可能結(jié)合在啟動(dòng)子區(qū)上的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位。 在人和小鼠間建立同

4、源基因關(guān)系 本實(shí)驗(yàn)室曾通過半定量RT-PCR觀察到低濃度MNNG可誘發(fā)POLK、H、I基因表達(dá)改變。0.2μmol·L-1MNNG導(dǎo)致細(xì)胞POLH和POLI表達(dá)水平在處理后6-24h間逐漸上升，升高約1倍；而POLK則下降。選取以上三人基因的mRNA參考序列(RefSeq)來建立人與小鼠的同源基因?qū)Γ杭疵總€(gè)mRNA序列用BLASTN程序與GenBank數(shù)據(jù)庫中的小鼠核酸序列進(jìn)行比對，找出與其匹配程度最高的mRNA序列，將該序列重

5、新用BLASTN程序與數(shù)據(jù)庫中人的核酸序列比對，如果其中匹配程度最高的序列與最初輸入的人mRNA序列一致，則將小鼠中這條序列的編碼基因作為人類該基因的同源基因。 轉(zhuǎn)錄物定位并建立同源啟動(dòng)子對 為保證進(jìn)行轉(zhuǎn)錄物定位的mRNA其5'端盡量接近轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，每個(gè)基因相關(guān)的mRNA都用ClustalX1.81進(jìn)行比較，確定5'端最完整的mRNA，并用MegaBLAST將cDNA與基因組序列比對，確定其5'端位置(見p78，附錄3)

6、。選取轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游1000bp和下游2000bp的序列為包含啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)。人基因的啟動(dòng)子位置進(jìn)一步用啟動(dòng)子預(yù)測軟件PromoterInspector、PromoterScan等進(jìn)行初步驗(yàn)證(見p31，表1)。 啟動(dòng)子中轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位的比較分析 用DBA程序，默認(rèn)設(shè)置，獲取每一對同源啟動(dòng)子對的保守區(qū)域(見p56，附錄1)。分別選取各個(gè)基因5'端上游3000bp，用MATCH程序搜索TRANSFAC的PWM中脊椎動(dòng)

7、物轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位數(shù)據(jù)庫，參數(shù)矩陣相似性(matrixsimilarity)的域值定為0.8。矩陣相似性參數(shù)的范圍是0.0-1.0，0.8的相似性已經(jīng)非常高。將MATCH的輸出結(jié)果保存于Excel表格中。再將每對基因所得的結(jié)果進(jìn)行比較，選取位于保守區(qū)內(nèi)，人和小鼠都含有的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位，作為該基因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位的最終輸出結(jié)果。 人POLK、H、I基因啟動(dòng)子區(qū)預(yù)測的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位及其序列(見p34，表3)。 二、由PO

8、LH，POLI和POLK基因啟動(dòng)子區(qū)控制的重組報(bào)告基因質(zhì)粒的構(gòu)建 設(shè)計(jì)引物對預(yù)測獲得的啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物回收后與pGEM-T載體鏈接，帶T載體的DH5α大腸桿菌送華大基因公司進(jìn)行測序鑒定，從測序結(jié)果可知，所克隆到的片段為預(yù)測獲得的序列。利用雙酶切技術(shù)對T載體進(jìn)行切割，同時(shí)利用相應(yīng)的酶對pSeap-basic質(zhì)粒進(jìn)行酶切，各自的酶切產(chǎn)物利用試劑盒回收并且進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物再轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增，提取重組質(zhì)粒雙酶切鑒