椎間隙感染后椎間盤(pán)內(nèi)抗生素藥物濃度與軟骨終板彌散功能改變的相關(guān)研究.pdf

1、研究背景:
　　 術(shù)后椎間隙感染主要累及椎間盤(pán)及相鄰椎體軟骨終板，術(shù)中細(xì)菌的直接播種是其主要病因。目前椎間隙感染發(fā)生率逐漸增多，但由于對(duì)本病缺乏認(rèn)識(shí)，容易出現(xiàn)誤診和漏診，延誤最佳治療時(shí)機(jī)，造成嚴(yán)重后果，若能早期診斷，并給予針對(duì)性治療，則預(yù)后良好，但是目前缺乏對(duì)術(shù)后椎間隙感染早期診斷的可靠依據(jù)。
　　 在椎間隙感染病程中，炎癥反應(yīng)會(huì)改變椎間盤(pán)局部的生化成分及微環(huán)境，軟骨終板的彌散功能處于一個(gè)動(dòng)態(tài)變化中。在抗生素類型選擇方面

2、，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為由于髓核內(nèi)含有豐富的帶負(fù)電荷的蛋白多糖，根據(jù)電荷相互作用原理，帶正電荷的藥物更易于進(jìn)入椎間盤(pán)。但是目前關(guān)于抗生素對(duì)于椎間盤(pán)滲透能力的研究，均是建立在正常的或是退變受損的椎間盤(pán)基礎(chǔ)上的，對(duì)于椎間隙感染后的椎間盤(pán)情況不得而知，理論上椎間隙感染后炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的椎間盤(pán)局部的生化成分及微環(huán)境改變，可能影響抗生素滲透入椎間盤(pán)的能力。
　　 在判斷抗生素能否在感染的椎間盤(pán)局部達(dá)到有效抑菌濃度，從而發(fā)揮治療作用時(shí)，既往主要根據(jù)臨床

3、經(jīng)驗(yàn)和影像學(xué)表現(xiàn)判斷，具有一定的滯后性，會(huì)延誤最佳時(shí)機(jī)治療，造成嚴(yán)重后果。連續(xù)動(dòng)態(tài)增強(qiáng)核磁共振掃描作為一種非侵襲性的可靠方法，已經(jīng)被廣泛用作動(dòng)物及人體椎間盤(pán)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的研究，提示此方法可能能用于判斷、預(yù)測(cè)抗生素能否進(jìn)入椎間盤(pán)內(nèi)。另外，在具體使用抗生素治療時(shí)，椎間盤(pán)的無(wú)血供特點(diǎn)使得按照常規(guī)用藥劑量時(shí)，往往在椎間盤(pán)局部難以達(dá)到有效血藥濃度，因而需要長(zhǎng)療程、大劑量的抗生素治療。但是長(zhǎng)療程、高濃度的抗生素在椎問(wèn)盤(pán)局部蓄積后，有可能損傷椎間盤(pán)細(xì)胞，

4、加重已發(fā)生炎癥的椎間盤(pán)細(xì)胞的損傷，不易于炎癥的控制，因而有必要判斷常用抗生素對(duì)于椎間盤(pán)細(xì)胞的影響。
　　 研究目的:
　　 建立穩(wěn)定的兔椎間隙感染模型，研究術(shù)后椎間隙感染的早期診斷方法；探討椎間隙感染病程中，軟骨終板及髓核組織學(xué)及生化學(xué)成分改變與椎間盤(pán)軟骨終板彌散功能變化的關(guān)系；測(cè)量椎間隙感染后不同時(shí)間點(diǎn)，椎間盤(pán)內(nèi)頭孢唑林鈉及克林霉素的藥物濃度，判斷通過(guò)椎間盤(pán)軟骨終板彌散功能預(yù)測(cè)椎間盤(pán)內(nèi)藥物濃度的可靠性；觀察高濃度的頭孢

5、唑林鈉及克林霉素對(duì)于髓核細(xì)胞活力及增殖能力的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1.取新西蘭兔18只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組，其中實(shí)驗(yàn)組12只，對(duì)照組6只。通過(guò)腰椎前外側(cè)入路，直視下將金黃色葡萄球菌或等量生理鹽水注入椎間隙，術(shù)后對(duì)C反應(yīng)蛋白及血沉動(dòng)態(tài)觀察，結(jié)合影像學(xué)檢查(X線、CT及MRI)，并取實(shí)驗(yàn)區(qū)椎間盤(pán)組織行細(xì)菌培養(yǎng)及病理學(xué)檢查。
　　 2.取新西蘭兔60只，制作椎間隙感染模型。在術(shù)后1、2、4、8、12周，每

6、次隨機(jī)取成功的椎間隙感染模型兔各8只、對(duì)照組兔4只。采用HE染色觀察軟骨終板組織形態(tài)學(xué)、免疫組化測(cè)定軟骨終板下血管內(nèi)皮細(xì)胞CD34及VEGF表達(dá)、RT-PCR測(cè)定髓核組織中Ⅱ型膠原蛋白、aggrecan蛋白mRNA表達(dá)、連續(xù)動(dòng)態(tài)增強(qiáng)MRI檢測(cè)椎間盤(pán)軟骨終板彌散功能。
　　 3.取新西蘭兔60只，制作椎間隙感染模型。在術(shù)后1、2、4、8、12周，每次隨機(jī)取成功的椎間隙感染模型兔12只，行連續(xù)動(dòng)態(tài)增強(qiáng)MRI測(cè)定椎間盤(pán)軟骨終板的彌散功

7、能后，12只椎間隙感染兔隨機(jī)分成2組，分別注射兩種常用抗生素：頭孢唑林鈉和克林霉素?？股孛扛粢粋€(gè)藥物半衰期注射一次，共計(jì)給藥5次，末次給藥后隔一個(gè)半衰期抽取血樣，隨后立即處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，解剖取得髓核樣本。通過(guò)高效液相-二級(jí)質(zhì)譜聯(lián)用方法測(cè)量血液及椎間盤(pán)內(nèi)藥物濃度。
　　 4.通過(guò)在體外分離、培養(yǎng)新西蘭兔髓核細(xì)胞，體外擴(kuò)增培養(yǎng)至第一代，采用MTT、CCK-8及RT-PCR等方法，檢測(cè)4個(gè)濃度(0mg/mL、0.25mg/mL、0.5

8、mg/mL、1mg/mL)的頭孢唑林鈉及克林霉素對(duì)于兔腰椎間盤(pán)髓核細(xì)胞活力及增殖能力的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1.細(xì)菌接種1周后MRI顯示實(shí)驗(yàn)椎間隙終板區(qū)信號(hào)增高，椎間盤(pán)信號(hào)基礎(chǔ)正常。第2周后注射金黃色葡萄球菌的所有動(dòng)物均出現(xiàn)椎間隙感染，C反應(yīng)蛋白及血沉均明顯升高，MRI出現(xiàn)特異性的表現(xiàn)，細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性，組織學(xué)檢查證實(shí)有椎間隙感染發(fā)生。注射生理鹽水組無(wú)椎間隙感染。C反應(yīng)蛋白與血沉相比，C反應(yīng)蛋白高峰出現(xiàn)早，回落周期

9、短，穩(wěn)定性好。
　　 2.在椎間隙感染1-4周時(shí)，軟骨終板上出現(xiàn)新生毛細(xì)血管，CD34及VEGF表達(dá)增多，髓核內(nèi)的蛋白多糖及Ⅱ型膠原含量減少，軟骨終板彌散功能逐漸增強(qiáng)；感染后4周時(shí)，新生毛細(xì)血管達(dá)到最多，CD34及VEGF表達(dá)最多，彌散功能達(dá)到最佳，4周后逐漸減少。在感染后8周時(shí)，蛋白多糖及Ⅱ型膠原破壞達(dá)到最強(qiáng)，8周后基質(zhì)破壞有所修復(fù)。軟骨終板CD34、VEGF的表達(dá)與軟骨終板彌散功能呈正相關(guān)關(guān)系，r=0.861及r=0.846

10、；蛋白多糖mRNA表達(dá)與軟骨終板彌散功能呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，r=-0.735。
　　 3.在椎間隙感染的髓核中，頭孢唑林鈉及克林霉素的通透性存在一個(gè)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程；感染的早期(1-4周)，頭孢唑林鈉及克林霉素對(duì)椎間盤(pán)的滲透率較同期的正常椎間盤(pán)高，在感染4周時(shí)達(dá)到最佳滲透率，平均10.96％及35.31％；在感染的中晚期(8-12周)，頭孢唑林鈉及克林霉素對(duì)椎間盤(pán)的滲透率逐漸下降。正常及感染髓核中頭孢唑林鈉濃度與椎間盤(pán)彌散功能呈正相關(guān)關(guān)系

11、，r=0.922及r=0.898；正常及感染髓核中克林霉素濃度與椎間盤(pán)彌散功能呈正相關(guān)關(guān)系，r=0.922及r=0.896。
　　 4.當(dāng)頭孢唑林鈉濃度超過(guò)0.5mg/mL、克林霉素濃度超過(guò)0.25mg/mL時(shí)，髓核細(xì)胞Ⅱ型膠原及蛋白多糖的表達(dá)下降，濃度在1.0mg/mL，時(shí)達(dá)到最低。頭孢唑林鈉濃度超過(guò)0.5mg/mL、克林霉素濃度超過(guò)0.25mg/m時(shí)，明顯影響細(xì)胞活力，小于以上濃度時(shí)細(xì)胞活性無(wú)明顯影響。
　　 結(jié)論:

12、
　　 1.通過(guò)前外側(cè)入路直視下將一定量的金黃色葡萄球菌注入兔腰椎間隙，成功的制造出穩(wěn)定的椎間隙感染模型，造模成功率高，可用于術(shù)后椎間隙感染的相關(guān)實(shí)驗(yàn)。腰椎術(shù)后CRP持續(xù)性或二次升高要考慮椎間隙感染的存在，與ESR比較，CRP具有靈敏性高、準(zhǔn)確性強(qiáng)、反應(yīng)周期短等優(yōu)點(diǎn)，可作為早期判斷腰椎術(shù)后椎間隙感染的重要指標(biāo)。腰椎術(shù)后1周時(shí)，MRI上手術(shù)間隙上下終板出現(xiàn)信號(hào)異常增高時(shí)，應(yīng)結(jié)合其他檢查及臨床表現(xiàn)，需高度懷疑椎間隙感染。MRI在術(shù)后

13、2周時(shí)可明確椎間隙感染診斷。
　　 2.椎間隙感染后軟骨終板的彌散功能處于一個(gè)動(dòng)態(tài)變化中，在感染后4周時(shí)彌散功能達(dá)到最佳。椎間隙感染后軟骨終板CD34、VEGF的表達(dá)與軟骨終板彌散功能呈正相關(guān)關(guān)系，髓核中蛋白多糖mRNA表達(dá)與軟骨終板的彌散功能呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。
　　 3.椎間隙感染后4周時(shí)是椎間盤(pán)對(duì)克林霉素及頭孢唑林鈉通透性的最佳時(shí)機(jī)，抗感染治療最好選擇在感染后4周內(nèi)進(jìn)行。椎間隙感染的椎間盤(pán)對(duì)于克林霉素的通透性優(yōu)于頭孢唑林