羅布麻總黃酮抗血栓作用物質(zhì)基礎(chǔ)及抗人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡作用機理研究.pdf

1、目的: 建立羅布麻總黃酮(TFF)標(biāo)準(zhǔn)色譜指紋圖譜，對TFF進行抗血栓藥理作用及體內(nèi)代謝過程研究，探討其抗血栓作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，通過體外人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的培養(yǎng)研究TFF及其主要成分金絲桃苷(hyperin)抑制過氧化氫誘導(dǎo)的HUVECs凋亡的作用及其機制。 方法: (1)采用HPLC-dAD法建立TFF標(biāo)準(zhǔn)色譜指紋圖譜，確保為后續(xù)藥理試驗和作用機理探討提供質(zhì)量均一、穩(wěn)定可控的供試樣品； (2)通

2、過大鼠靜脈血栓模型實驗，膠原蛋白—腎上腺素誘導(dǎo)小鼠血栓模型實驗，小鼠凝血時間測定及凝血酶原時間測定，放免法對大鼠血漿中TXB2、6—keto-PGF1α含量的測定來研究TFF的抗血栓作用； (3)通過HPLC，LC/MS/MS及UPLC/MS/MS技術(shù)，研究TFF在大鼠胃腸內(nèi)的吸收與轉(zhuǎn)化、研究口服和靜注給藥TFF后大鼠血漿和血清相關(guān)成分及初步藥代動力學(xué)； (4)建立過氧化氫誘導(dǎo)的HUVECs凋亡模型，采用MTT觀察不同濃

3、度TFF和Hyperin對HUVECs增殖的影響，流式細(xì)胞儀檢測對HUVECs細(xì)胞周期變化、凋亡率及ROS釋放的影響，AO/EB染色法觀察對HUVECs形態(tài)學(xué)改變的影響，比色法檢測對細(xì)胞培養(yǎng)液中NO和SOD的活性、MDA和LDH的含量的改變，免疫組化法測定對NF—κB和VEGF的表達的影響，采用雙抗夾心ELISA法測定對細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TF和TFPI的濃度的影響； (5)應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡，采用新型熒光染料Flou3—AM檢測

4、細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化，以羅丹明123作為染料檢測線粒體跨膜電位變化，采用RT-PCR檢測Caspase-3、Bcl-2、Bax基因表達，Westernblot分析CytC、Caspase-9和Caspase-3等蛋白的表達，探討TFF和Hyperin抑制H2O2誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞凋亡的機制。 結(jié)果: (1)建立了TFF標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，以金絲桃苷為參比峰共確定了17個共有峰，與在相同的色譜條件下測定的羅布麻葉藥材圖譜

5、有很好的相關(guān)性。建立的方法精密度、穩(wěn)定性及重現(xiàn)性較好，專屬性強，可全面控制TFF的質(zhì)量，確保為后續(xù)藥理試驗和作用機理探討提供質(zhì)量均一、穩(wěn)定可控的供試樣品； (2)對靜脈血栓形成的影響實驗中，TFF具有明顯的抑制靜脈血栓的作用，其中高、中劑量組血栓干重與濕重與正常對照組相比均有顯著性差異(p＜0.001)，對血栓濕重的抑制率分別為73.0％，83.4％：不同劑量的TFF對膠原—腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠血栓性偏癱或死亡數(shù)與正常對照組相比明

6、顯減少，均有明顯的保護作用，但各給藥組比較無顯著性差異；對凝血功能的影響實驗中，TFF中、高劑量組能顯著延長正常小鼠的凝血時間，影響小鼠的凝血功能(p＜0.05)，能顯著延長家兔凝血酶原時間和部分凝血酶原時間(p＜0.05)，提示TFF可能通過抑制內(nèi)源性、外源性凝血途徑產(chǎn)生抗凝血作用；對大鼠血漿中TXB2、6—keto-PGF1α含量的影響實驗表明，與正常對照組比較TFF中、高劑量組使大鼠血漿中TXB2含量明顯下降，6—keto-PGF

7、1α的含量明顯升高(p＜0.05或p＜0.01)； (3)以金絲桃苷、異槲皮苷為考察指標(biāo)，采用大鼠在體灌流模型，通過HPLC測定灌流TFF前后兩成分的含量，計算其在胃腸中的吸收率，結(jié)果在大鼠胃中2h的平均吸收率：金絲桃苷為36.92％，異槲皮苷為36.49％，在大鼠腸中2h的平均吸收率：金絲桃苷為47.7％，異槲皮苷為48.25％，表明金絲桃苷和異槲皮苷在大鼠胃腸部均有吸收，但兩成分在腸部的吸收比胃部較好；通過檢測靜脈及口服給藥

8、TFF后大鼠血漿中有關(guān)物質(zhì)，結(jié)果大鼠靜脈給藥5分鐘和15分鐘后大量測到異槲皮苷和金絲桃苷，同時也檢測到少量的槲皮素二項結(jié)合物(槲皮素的葡萄糖醛酸結(jié)合和硫酸酯化結(jié)合代謝產(chǎn)物)。口服給藥TFF后于15分鐘和4小時在血中沒有發(fā)現(xiàn)異槲皮苷和金絲桃苷，但卻發(fā)現(xiàn)大量槲皮素的二相代謝產(chǎn)物；通過檢測靜脈及口服給藥TFF后大鼠血清中有關(guān)物質(zhì)，結(jié)果兩種給藥途徑血清成分有很大差別，口服給藥30min血清中總黃酮的主要成分金絲桃苷和異槲皮苷均未以原型成分出現(xiàn)，

9、提示發(fā)生了轉(zhuǎn)化，而靜脈給藥30min后血清中可見金絲桃苷和異槲皮苷原型成分，以及口服后出現(xiàn)的一些成分，表明靜注給藥部分發(fā)生了轉(zhuǎn)化。并根據(jù)相應(yīng)的質(zhì)譜圖m/z結(jié)合文獻初步推測可能含有的成份有：槲皮素、槲皮素+葡萄糖醛酸、酸化的三葉豆苷(或紫云英苷)、檉柳素、檉柳素-7—O—葡萄糖醛酸等，轉(zhuǎn)化途徑可能有甲基化、葡萄糖醛酸化和硫酸酯化等；初步藥代動力學(xué)結(jié)果顯示未經(jīng)水解的血樣中測到的槲皮素濃度很低，而水解后的同一批血樣中測到了大量的槲皮素，推測水

10、解后測到的大量的槲皮素是由吸收入體的異槲皮苷和金絲桃苷(槲皮素糖苷成分)或槲皮素代謝物所貢獻的。比較水解后口服和靜脈給藥槲皮素的曲線下面積，得到體內(nèi)黃酮類化合物總的口服生物利用度為59.8％。 (4)終濃度為200μmol/lH2O2可明顯誘導(dǎo)HUVECs形成包括細(xì)胞固縮，染色質(zhì)凝聚等特征的凋亡模型，為進一步探討TFF和Hyperin對血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷保護作用及其機制提供手段；MTT、FCM等方法測定結(jié)果顯示，與正常細(xì)胞組比

11、，H2O2模型組細(xì)胞增殖活性下降，細(xì)胞凋亡率明顯增加，G0/G1期細(xì)胞比率增加，S期細(xì)胞和G2/M期細(xì)胞比率明顯降低，可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的ROS，并出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡特征，培養(yǎng)上清液中NO和SOD活性明顯下降，MDA和LDH的釋放量明顯增加，NF—κB的表達明顯增加VEGF表達明顯下降(P＜0.01)，不同濃度的TFF和Hyperin作用后，均能明顯抑制和改變H2O2引起的上述改變(P＜0.05或P＜0.01)。表明TFF和Hyperin對

12、H2O2引起HUVECs損傷具有確切的保護作用，能明顯抑制H2O2誘導(dǎo)的HUVECs凋亡，其作用機制可能與其確切的抗氧化作用及調(diào)節(jié)NF—κB和VEGF的表達有關(guān)；測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TF和TFPI的濃度實驗結(jié)果顯示，與模型組比較，不同濃度TFF和hyperin能劑量依賴性地抑制H2O2刺激引起的TF含量升高，而TFPI的變化與TF相反(P＜0.05或P＜0.01)，這種變化也可能是TFF和Hyperin抗血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和抗血栓形成的機

13、制之一； (5)與正常組比較，H2O2作用后的HUVECs胞內(nèi)Ca2+嚴(yán)重超載，線粒體跨膜電位顯著降低(P＜0.01)；Bax基因表達明顯增加，Bcl-2基因表達明顯減小，Caspase-3，Caspase-9和CytC蛋白表達明顯增加(P＜0.05或P＜0.01)，證實H2O2通過激活經(jīng)典的線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與文獻報道一致。給予不同濃度的TFF和Hyperin作用后，與H2O2模型組比較，可明顯抑制H2O2所引起的HUV

14、ECs細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，能明顯促進Bcl-2基因表達，減少Bax基因的表達，從而抑制線粒體的通透性，恢復(fù)氧化損傷降低的膜電位(P＜0.05或P＜0.01)，同時能明顯降低CytC，Caspase-9和Caspase-3蛋白表達(P＜0.05或P＜0.01)，表明TFF和Hyperin可能是通過抑制Ca2+超載，促進Bcl-2表達，減少Bax的表達，抑制Bax由胞漿向線粒體轉(zhuǎn)位，使得線粒體通透性降低，膜電位得到恢復(fù)，阻止線粒體Cyt

15、C的釋放，阻止了Caspase-9和Caspase-3的激活，從而通過阻斷線粒體凋亡通路來抑制H2O2誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞凋亡。 結(jié)論: (1)建立了TFF標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，為后續(xù)藥理試驗和作用機理探討提供質(zhì)量均一、穩(wěn)定可控的供試樣品提供保障； (2)通過抗血栓主要藥理學(xué)研究，證明TFF具有確切的抗血栓作用； (3)采用HPLC、LC/MS/MS及UPLC/MS/MS技術(shù)基本闡明了TFF給藥后體內(nèi)的吸收轉(zhuǎn)化

16、及代謝過程等，初步探討了TFF發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)； (4)確證了TFF和Hyperin對H2O2引起HUVECs損傷具有明顯的保護作用，能明顯抑制H2O2誘導(dǎo)的HUVECs凋亡，其作用機制可能與其確切的抗氧化作用及調(diào)節(jié)NF—κB和VEGF的表達有關(guān)，也可能與細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TF和TFPI的濃度變化有關(guān)； (5)研究證實H2O2主要通過激活經(jīng)典的線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，故本文重點探討了線粒體途徑Caspases凋亡信號