六種病毒外殼蛋白亞細(xì)胞定位及對(duì)煙草抗性影響的比較分析.pdf

1、植物病毒病是僅次于真菌病害的第二大病害，嚴(yán)重危害重要的經(jīng)濟(jì)作物和糧食作物，并且危害程度逐年加重。隨著基因工程的迅速發(fā)展，抗病育種成為防治病毒病的有效手段之一。其中應(yīng)用最為廣泛的是利用病毒的外殼蛋白（coat protein，CP）基因轉(zhuǎn)化植物，使其獲得抗性，這與病毒外殼蛋白基因組結(jié)構(gòu)、功能及在細(xì)胞中的定位有一定的聯(lián)系。不同病毒的CP在病毒的侵染過程中所起的作用不同，其在植物細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位和引起植物產(chǎn)生的抗性也應(yīng)該不同。因此，本文比較

2、分析了本實(shí)驗(yàn)室目前所有的共計(jì)六種病毒的CP亞細(xì)胞定位及瞬時(shí)表達(dá)對(duì)植物的影響，以期為更詳細(xì)的理解不同病毒CP在病毒致病中的作用及不同病毒CP在誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性中的作用提供更多的依據(jù)。六種病毒分別是煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)、馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)、蕪菁花葉病毒(Turnip mosaic virus，TuMV)、馬鈴薯X病毒(Potato virus X，PVX)、煙草曲

3、莖病毒(Tobacco curly shoot virus，TbCSV)、煙草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）。
　　本文根據(jù)Genebank中五種病毒外殼蛋白全長(zhǎng)設(shè)計(jì)含酶切位點(diǎn)的引物，以RNA為模板，PCR擴(kuò)增外殼蛋白全長(zhǎng)，插入載體中間pSAT1-EGFP-C1或pSAT6-EGFP-N1上，利用PCR篩選及酶切鑒定得到中間重組載體質(zhì)粒，再用PI-PSP I或ASC I單酶切，插入到最終植物表達(dá)載體p

4、PZP-RCS1，同樣利用PCR篩選及酶切鑒定得到含CP的重組克隆，用凍融法將重組克隆（其中TMV CP的植物表達(dá)載體已在本實(shí)驗(yàn)室前期完成）導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105，菌液PCR及酶切鑒定證明質(zhì)粒均已成功導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中。
　　用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)觀察它們?cè)诒臼蠠?、云煙中的亞?xì)胞定位，進(jìn)行初步的比較分析。結(jié)果顯示：不同的病毒CP在同種植株中的亞細(xì)胞定位存在差異性，如在本氏煙中PVX、PVY、TuMV、TMV外殼蛋

5、白都存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜（或細(xì)胞壁）上，TuMV、TMV、TRV外殼蛋白可進(jìn)入細(xì)胞核；這幾種病毒在細(xì)胞質(zhì)中形成的結(jié)構(gòu)也有差異，如：PVY、TuMV、TMV、TRV形成一些絲狀結(jié)構(gòu)，其中TMV、TRV絲狀結(jié)構(gòu)較多，而且TRV有泡囊結(jié)構(gòu)，但PVX外殼蛋白在細(xì)胞質(zhì)中則是形成較大的聚集體；而雙生病毒TbCSV外殼蛋白與其他五種病毒明顯不同，主要分布在細(xì)胞周邊，以一些不連續(xù)小點(diǎn)分布在細(xì)胞壁上，細(xì)胞質(zhì)中以多聚體的形式存在，在膜上聚集成小體。此外，只

6、有PVX、TbCSV的外殼蛋白存在于葉綠體及氣孔中。在云煙中的PVY、TbCSV與其在本氏煙中定位情況相同，而其他四種病毒有些不同，如：PVX、TRV外殼蛋白表達(dá)量都有所降低，TuMV表達(dá)量雖然仍較高，但GFP熒光強(qiáng)度減弱，而TMV外殼蛋白在葉片中的表達(dá)量顯著增強(qiáng)；另外PVX主要分布在細(xì)胞膜上，形成較少的聚合體；TuMV細(xì)胞質(zhì)中絲狀結(jié)構(gòu)較少，但形成的聚合體有所增加；TRV細(xì)胞質(zhì)中絲狀結(jié)構(gòu)及囊泡結(jié)構(gòu)明顯減少。
　　本實(shí)驗(yàn)室的前期工作

7、中發(fā)現(xiàn)ToMV、TMV CP與煙草蛋白IP-L存在互作關(guān)系，為了進(jìn)一步了解IP-L與ToMV CP互作是否存在特異性，本文在前期的基礎(chǔ)上，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)將構(gòu)建好的CP與IP-L共注射，觀察它們的共定位情況。結(jié)果表明PVX、TuMV、TRV、TbCSV CP與IP-L存在共定位，推測(cè)它們之間可能存在互作關(guān)系，而PVY CP與IP-L未觀察到共定位情況。
　　植物在受到病原物侵染后，植物體內(nèi)的相關(guān)抗性水平會(huì)有所升高。為了

8、了解CP對(duì)植株產(chǎn)生抗病性是否相關(guān)以及不同病毒間引起抗病性的差異性比較，本文對(duì)CP瞬時(shí)表達(dá)后的云煙葉片進(jìn)行了防御酶（超氧化物歧化酶SOD、過氧化物酶POD、多酚氧化酶PPO、過氧化氫酶CAT）活性和葉綠素含量的測(cè)定。結(jié)果顯示，防御酶活性在接種后五天都有不同程度的增強(qiáng)，所有處理組葉片中葉綠素a、總?cè)~綠素、葉綠素a/b都明顯降低，而葉綠素b除TMV CP處理組外，其他處理組也都減少。為了進(jìn)一步說明CP對(duì)植物的抗病性有一定的影響，將成功瞬時(shí)表達(dá)