下調(diào)棉花3-酮基二氫鞘氨醇還原酶基因(GhKDSR2-1)的表達(dá)對(duì)棉纖維發(fā)育的影響.pdf

1、棉花是我國(guó)的重要經(jīng)濟(jì)作物，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中具有重要作用。棉花纖維是重要的天然纖維來(lái)源。棉纖維細(xì)胞是由胚珠外珠被表皮細(xì)胞經(jīng)快速突起和急速伸長(zhǎng)而形成的單細(xì)胞，具有極度伸長(zhǎng)的細(xì)胞形態(tài)。其生長(zhǎng)發(fā)育經(jīng)歷了起始期、快速伸長(zhǎng)期、成熟期和脫水期，是研究植物細(xì)胞發(fā)育的理想材料。同時(shí)，纖維細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程也是棉花纖維產(chǎn)量和品質(zhì)的形成過(guò)程，研究纖維細(xì)胞的發(fā)育及其調(diào)控機(jī)理是解析棉花纖維產(chǎn)量和品質(zhì)（長(zhǎng)度和細(xì)度等）形成機(jī)理的重要環(huán)節(jié)，將為進(jìn)一步培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)棉花提供理論基

2、礎(chǔ)。近年來(lái)對(duì)棉花纖維發(fā)育的研究取得了一定進(jìn)展，但目前調(diào)控棉纖維發(fā)育的分子機(jī)制仍不清楚。
　　鞘脂(sphingolipids)是含有長(zhǎng)鏈鞘樣堿基骨架的一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的脂類分子，種類繁多，廣泛存在于生物膜結(jié)構(gòu)中。鞘脂及其衍生物是許多細(xì)胞活動(dòng)進(jìn)程中重要的動(dòng)力調(diào)節(jié)器，參與了許多重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，不同種類的鞘脂存在于不同組織中，甚至是不同組織的不同細(xì)胞類型中，目前對(duì)植物中鞘脂的研究甚少。在棉纖維細(xì)胞極性伸長(zhǎng)過(guò)程中，生物膜系統(tǒng)的面積極度擴(kuò)張

3、，務(wù)必需要不同鞘脂分子的相應(yīng)增加，以滿足各種生理生化活動(dòng)所需，從而協(xié)調(diào)完成伸長(zhǎng)過(guò)程。因此鞘脂的正常合成在纖維細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育中可能發(fā)揮了重要作用。
　　為了研究鞘脂在棉花纖維細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育中的作用，首先克隆了棉花中3-酮基二氫鞘氨醇還原酶基因的同源基因GhKDSR2s，然后構(gòu)建反義表達(dá)載體并進(jìn)行棉花的遺傳轉(zhuǎn)化，探索了下調(diào)GhKDSR2-1對(duì)棉花植株和纖維生長(zhǎng)發(fā)育的影響，主要結(jié)果如下:
　　1.GhKDSR2s基因的克隆和序列分析<

4、br>　　以陸地棉徐州142野生型10dpa的纖維cDNA為模板，擴(kuò)增得到2個(gè)同源的GhKDSR2基因。其中克隆到的GhKDSR2-1的cDNA序列包含一個(gè)996bp的ORF，推導(dǎo)的ORF編碼331個(gè)氨基酸殘基，分子量36.0kD,IP=8.065。克隆到的GhKDSR2-2的cDNA序列包含一個(gè)999bp的ORF，推導(dǎo)的ORF編碼332個(gè)氨基酸殘基，分子量36.2kD,IP=7.436。GhKDSR2與擬南芥、可可、蓖麻等物種的3-酮

5、基二氫鞘氨醇還原酶基因具有較高的同源性。這些分析結(jié)果說(shuō)明我們克隆得到的序列是棉花3-酮基二氫鞘氨醇還原酶基因的同源基因。
　　2.GhKDSR2-1基因的表達(dá)特性
　　為了明確克隆得到的兩個(gè)GhKDSR2基因表達(dá)特性，利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR分別檢測(cè)了其在野生型棉花的不同組織器官、纖維和胚珠不同發(fā)育時(shí)期，以及纖維突變體的幾個(gè)重要時(shí)期的表達(dá)水平。結(jié)果表明，GhKDSR2在檢測(cè)樣品中均有表達(dá)，但其表達(dá)水平存在明顯差異。在纖維發(fā)育

6、過(guò)程中其表達(dá)峰值出現(xiàn)在快速伸長(zhǎng)期，說(shuō)明GhKDSR2基因與纖維細(xì)胞伸長(zhǎng)有一定關(guān)系；進(jìn)一步檢測(cè)了該基因在纖維發(fā)育突變體中的表達(dá)差異，結(jié)果表明在徐州142無(wú)絨無(wú)絮突變體的纖維起始期和超短纖維突變體的纖維快速伸長(zhǎng)期，GhKDSR2的表達(dá)相較于野生型都有明顯下降，說(shuō)明GhKDSR2在纖維的起始和伸長(zhǎng)階段可能發(fā)揮了重要作用。
　　3.反義抑制GhKDSR2-1對(duì)棉花植株生長(zhǎng)發(fā)育的影響
　　利用GhKDSR2序列構(gòu)建反義抑制植物表達(dá)載體

7、，并進(jìn)行棉花的遺傳轉(zhuǎn)化。通過(guò)GUS組織化學(xué)染色和PCR擴(kuò)增鑒定獲得7個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花的性狀變異進(jìn)行觀測(cè)和統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示下調(diào)GhKDSR2導(dǎo)致了植株矮小纖細(xì)，生長(zhǎng)緩慢，難以成活；花小，花粉少且嚴(yán)重?cái)∮?，因此難以穩(wěn)果；棉桃變小，發(fā)育緩慢，且每個(gè)棉桃中僅有1-2粒種子發(fā)育成熟；葉片變小、顏色變深且表面粗糙。隨后進(jìn)一步對(duì)葉片中葉綠素和木質(zhì)素含量進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其葉綠素和木質(zhì)素含量升高，木質(zhì)素分布區(qū)域增多。結(jié)果表明，抑制GhKDSR2-1

8、表達(dá)，棉花植株生長(zhǎng)發(fā)育受到嚴(yán)重干擾。
　　4.反義抑制GhKDSR2-1對(duì)棉花纖維細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的影響
　　為了明確GhKDSR2-1對(duì)棉花纖維細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的影響，首先采用棉花胚珠離體培養(yǎng)方法，檢測(cè)了轉(zhuǎn)基因纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制 GhKDSR2-1的表達(dá)明顯抑制纖維細(xì)胞的伸長(zhǎng)，此結(jié)果與FB2（鞘脂合成抑制劑）處理野生型纖維的結(jié)果一致，說(shuō)明植物鞘脂的正常合成在纖維細(xì)胞伸長(zhǎng)中具有重要作用。轉(zhuǎn)基因成熟纖維的測(cè)量結(jié)果表明

9、，抑制GhKDSR2-1的轉(zhuǎn)基因纖維長(zhǎng)度明顯降低，與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因纖維長(zhǎng)度降低了18.4％。該結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明GhKDSR2基因在纖維伸長(zhǎng)中有著重要作用。掃描電鏡觀察的結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因纖維細(xì)胞的起始受到抑制，起始數(shù)量明顯減少。這些結(jié)果證明下調(diào)GhKDSR2-1抑制了纖維了起始和伸長(zhǎng)，說(shuō)明GhKDSR2在纖維起始和伸長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。
　　5.下調(diào)GhKDSR2-1抑制棉花種子中脂類合成，提高蛋白質(zhì)含量
　　反義抑制Gh