腫瘤微環(huán)境中F4-80+CD11b+Gr-1+單核細(xì)胞活化機(jī)制的研究.pdf

1、既往認(rèn)為巨噬細(xì)胞能分泌多種細(xì)胞因子，通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及促進(jìn)T細(xì)胞凋亡等機(jī)制產(chǎn)生腫瘤抑制作用。但近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞雖然也能分泌多種細(xì)胞因子但卻失去了對(duì)腫瘤細(xì)胞的反應(yīng)性，同時(shí)巨噬細(xì)胞的某些表型也發(fā)生了一定的改變，它的功能從抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變?yōu)榇龠M(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。作為巨噬細(xì)胞的前體細(xì)胞，骨髓來(lái)源的單核細(xì)胞（bone marrow-derived monocytes，BMDMs），即F4/80+CD11b+細(xì)胞及其相關(guān)產(chǎn)物

2、在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，但其活化機(jī)制及產(chǎn)生促瘤功能的機(jī)理至今尚不清楚。
　　 在此研究中，我們首先發(fā)現(xiàn)與腫瘤細(xì)胞相互作用后的巨噬細(xì)胞可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，且其促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的功能并不依賴(lài)于巨噬細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞間的相互接觸，而是由于二者在相互作用的過(guò)程中釋放出的某些物質(zhì)所引起。同時(shí)發(fā)現(xiàn)與大量腫瘤細(xì)胞相互作用后的巨噬細(xì)胞可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，而與小量腫瘤細(xì)胞相互作用后的巨噬細(xì)胞并沒(méi)有產(chǎn)生促腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。我們推

3、測(cè)可能是由于腫瘤細(xì)胞大量死亡后的釋放物對(duì)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生了影響。因此我們采用了反復(fù)凍融法制備壞死腫瘤細(xì)胞釋放物（molecules from necrotic tumor cells，NTC-Ms）模擬腫瘤微環(huán)境進(jìn)行研究，證實(shí)了在腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞具有促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的生物學(xué)功能。
　　 通過(guò)進(jìn)一步分析腫瘤組織單個(gè)細(xì)胞、不同腫瘤小鼠骨髓來(lái)源的F4/80+CD11b+細(xì)胞和腫瘤組織培養(yǎng)上清趨化而來(lái)的F4/80+CD11b+外周血單核細(xì)胞

4、發(fā)現(xiàn)它們均為Gr-1+。我們推測(cè)腫瘤組織釋放趨化因子使骨髓中未成熟單核細(xì)胞（F4/80+CD11b+Gr-1+細(xì)胞）入血，并阻礙其進(jìn)一步分化成熟，使其喪失單核/巨噬細(xì)胞的殺腫瘤細(xì)胞功能，成為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor associated macrophages，TAMs）的前體細(xì)胞。在隨后的研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)NTC-Ms處理后的正常小鼠骨髓細(xì)胞轉(zhuǎn)變成為具有免疫抑制表型的細(xì)胞，表達(dá)精氨酸酶I(Arginase 1，ArgI)和誘導(dǎo)型一氧化

5、氮合酶(Inducible nitricoxide synthase，iNOS or Nos2)，同時(shí)分泌白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)和白細(xì)胞介素-12(interleukin-12，IL-12)，并可抑制活化的CD4 +和CD8+T細(xì)胞的增殖。由此可見(jiàn)，腫瘤組織中的F4/80+CD11b+Gr-1+細(xì)胞在保留其單核細(xì)胞表面標(biāo)志的情況下，其功能已發(fā)生改變。
　　 接著我們探究了F4/80+CD11

6、b+Gr-1+細(xì)胞功能發(fā)生改變及活化的原因。首先我們發(fā)現(xiàn)正常小鼠骨髓來(lái)源的單核細(xì)胞（normal bone marrow-derived monocytes，N-BMDMs）、腫瘤小鼠骨髓來(lái)源的單核細(xì)胞（tumor-bearing bone marrow-derived monocytes，T-BMDMs）和TAMs中F4/80+CD11b+Gr-1+細(xì)胞均表達(dá)TLR2和TLR4，故我們研究了其下游的核轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)果顯示NTC-Ms不能

7、有效激活NF-κB而僅能活化IRF-3，表明在BMDMs中MyD88依賴(lài)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是缺失的，NTC-Ms可能是通過(guò)TRIF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)BMDMs發(fā)揮作用。我們進(jìn)一步采用了Toll-白細(xì)胞介素-1受體結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)干擾素接頭分子（TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β，TRIF）通路的特異性抑制劑白藜蘆醇（resveratrol，Res），發(fā)現(xiàn)Res可明顯抑制由NTC-Ms

8、引起的Arg1、Nos2、IL-10和 IL-12的表達(dá)變化，也可抑制由NTC-Ms引起的活化的T細(xì)胞凋亡，提示NTC-Ms可能是通過(guò)TLR4介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而產(chǎn)生生物學(xué)作用。在此基礎(chǔ)上，去除NTC-Ms中的RNA成分后對(duì)IRF-3的激活以及Arg1、Nos2、IL-10和 IL-12的表達(dá)并無(wú)影響，證實(shí)RNA并沒(méi)有參與這個(gè)過(guò)程。這些結(jié)果共同說(shuō)明，NTC-Ms對(duì)BMDMs的活化可能是通過(guò)NTC-Ms中的蛋白質(zhì)成分激活TLR4的MyD8

9、8非依賴(lài)途徑的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)完成的。
　　 在MyD88途徑缺陷的情況下，完全活化骨髓細(xì)胞需要TLR4和IFN-γ的共同作用，接下來(lái)我們研究腫瘤微環(huán)境中的IFN-γ在BMDMs分化中的作用。在研究中發(fā)現(xiàn)IFN-γ可抑制BMDMs誘導(dǎo)的活化T細(xì)胞的凋亡，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。但隨著腫瘤的生長(zhǎng)，在IFN-γ受體表達(dá)量不變的情況下T-BMDMs對(duì)IFN-γ的反應(yīng)性越來(lái)越低，因此我們推測(cè)腫瘤微環(huán)境可能降低了T-BMDMs對(duì)IFN-γ的反應(yīng)

10、性。我們同時(shí)觀察到IL-10可抑制NTC-Ms誘導(dǎo)的Nos2和 IL-12的表達(dá)并且對(duì)由NTC-Ms刺激后N-BMDMs 誘導(dǎo)的CD4+和CD8+T細(xì)胞的凋亡有明顯的協(xié)同作用。Western-blot結(jié)果顯示，IFN-γ可活化N-BMDMs和T-BMDMs磷酸化STAT1，而IL-10則活化磷酸化STAT3的表達(dá)。這些結(jié)果說(shuō)明，在腫瘤微環(huán)境中，由于T-BMDMs對(duì)IFN-γ反應(yīng)性越來(lái)越低而IL-10分泌不斷增加，使得STAT1活化減少而

11、STAT3大量激活，最終導(dǎo)致CD4+和CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生凋亡進(jìn)而產(chǎn)生免疫耐受、抑制Nos2和 IL-12的表達(dá)使F4/80+CD11b+Gr-1+細(xì)胞向M2表型轉(zhuǎn)換。
　　 綜上所述，在本研究中我們對(duì)腫瘤微環(huán)境對(duì)F4/80+CD11b+Gr-1+細(xì)胞的影響、F4/80+CD11b+Gr-1+細(xì)胞的來(lái)源、TLRs在F4/80+CD11b+Gr-1+細(xì)胞活化過(guò)程中的作用以及IFN-γ和IL-10在F4/80+CD11b+Gr-1+細(xì)