柞蠶抗菌肽Cectopin-like的鑒定與功能分析.pdf

1、柞蠶是一種重要的絹絲昆蟲。本研究從大腸桿菌誘導(dǎo)處理的柞蠶轉(zhuǎn)錄組中篩選得到一新的抗菌肽Cecropin-like（ApCec）。利用軟件EditSeq預(yù)測(cè)其ORF框含195個(gè)核甘酸。解剖得到大腸桿菌誘導(dǎo)的柞蠶幼蟲組織并提取RNA再反轉(zhuǎn)錄得到cDNA模板體。通過擴(kuò)增、連接、轉(zhuǎn)化、測(cè)序以及核酸序列比對(duì)確定所發(fā)現(xiàn)抗菌肽 ApCec基因在柞蠶體內(nèi)真實(shí)存在且與轉(zhuǎn)錄組中對(duì)應(yīng)的核酸序列一致?？咕?ApCec全長 cDNA編碼的肽含有64個(gè)氨基酸殘基，

2、這其中包括一個(gè)含22個(gè)氨基酸殘基的預(yù)測(cè)信號(hào)肽，4個(gè)氨基酸殘基的前肽和38個(gè)氨基酸殘基的成熟肽。氨基酸序列比對(duì)表明成熟抗菌肽ApCec與其他成熟抗菌肽Cecropin氨基酸序列比較保守。利用已公開報(bào)道抗菌肽Cecropin的氨基酸序列以及預(yù)測(cè)的抗菌肽 ApCec氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹顯示總共聚為雙翅目與鱗翅目兩簇，抗菌肽 ApCec歸屬于鱗翅目簇且與該簇內(nèi)聚為更小一簇抗菌肽Cecropin同源性較高。
　　用大腸桿菌（Escheric

3、hia coli）誘導(dǎo)柞蠶24 h后通過定量PCR檢測(cè)抗菌肽ApCec在脂肪體、馬氏管、絲腺、中腸、血細(xì)胞以及表皮組織中的分布，結(jié)果顯示抗菌肽ApCec基因在脂肪體、馬氏管、血細(xì)胞以及表皮中表達(dá)水平均較高，而其在馬氏管中表達(dá)水平最高。
　　本研究中人工化學(xué)合成了兩個(gè)肽：pro-ApCec(含前肽和成熟肽)和 M-ApCec（成熟肽），且合成的兩個(gè)肽都分別用高效液相色譜檢測(cè)其純度以及用質(zhì)譜檢測(cè)其分子量。通過MIC實(shí)驗(yàn)和抑菌圈試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)

4、，抗菌肽M-ApCec抗大腸桿菌K12（Escherichia coli K12）或枯草桿菌（Bacillus subtilis）活性都比抗菌肽 pro-ApCec更強(qiáng)，同時(shí)抗菌肽M-ApCec抗菌具有劑量效應(yīng)。以小鼠血細(xì)胞為抗菌肽M-ApCec作用對(duì)象，該溶血性實(shí)驗(yàn)表明成熟的抗菌肽M-ApCec對(duì)以小鼠血細(xì)胞為代表的哺乳動(dòng)物細(xì)胞毒性較低。
　　通過圓二色譜法檢測(cè)抗菌肽 M-ApCec在親水環(huán)境和疏水環(huán)境中結(jié)構(gòu)，結(jié)合曲線圖和所算數(shù)

5、據(jù)表明抗菌肽 M-ApCec在親水環(huán)境中二級(jí)結(jié)構(gòu)呈不規(guī)則狀態(tài)而在疏水性環(huán)境中二級(jí)結(jié)構(gòu)為α-螺旋。用抗菌肽M-ApCec處理革蘭氏陰性菌大腸桿菌K12和革蘭氏陽性菌枯草桿菌，并用透射電鏡觀察細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大腸桿菌 K12和枯草桿菌細(xì)胞膜被破壞，說明抗菌肽 M-ApCec通過破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性從而達(dá)到殺死細(xì)菌的目的。
　　本研究結(jié)果說明抗菌肽 ApCec在柞蠶體內(nèi)為抵御病原微生物對(duì)柞蠶的侵害發(fā)揮著重要作用，同時(shí)通過對(duì)新發(fā)現(xiàn)抗菌