JAK-STAT信號途徑在腎小管上皮細胞轉分化中的作用及AT1Ra和補腎活血方劑的影響.pdf

1、目的：腎小管間質纖維化(tubulointerstitial fibrosis,TIF)幾乎是所有慢性腎臟疾病進行性發(fā)展的共同通路，是導致終末期腎病的主要病理基礎。大量的研究表明，在各種原因引起的慢性腎臟疾病中，腎間質纖維化都可作為腎功能惡化的一個十分準確的預測指標。腎間質纖維化的程度與腎功能的相關性比腎小球硬化與腎功能的相關性更為密切。腎間質纖維化的一個重要機制就是肌成纖維細胞(myofiberoblast,Myof)增多及活化。目前

2、Myof的來源還不完全清楚，但越來越多的研究證實腎小管上皮細胞的表型轉化，或者稱為腎小管上皮細胞一肌成纖維細胞轉變(epithelial- myofiberoblast transition，EMT)是其主要來源之一，但其信號傳導機制至今尚未闡明。Janus kinase/signal transducer and activators of transcripti on (JAK/STAT)信號途徑能介導多種細胞因子和生長因子的細胞內

3、信號轉導過程，與細胞的增殖、分化、凋亡等多種行為密切相關。研究表明，高糖和血管緊張素Ⅱ等均可激活體外培養(yǎng)的腎小球系膜細胞JAK/STAT 途徑。但此信號途徑在腎小管上皮細胞轉分化中的作用鮮見研究報道。血管緊張素轉換酶抑制劑(angiotensin-converting enzyme inhibitor，ACEI)和血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑(angiotensin recepter blockade，ARB)具有腎臟保護作用，已成為治療慢性

4、腎衰的常用藥物，但其對EMT的影響目前研究較少。 本研究應用高糖培養(yǎng)人腎小管上皮細胞株(HKC)和大鼠5/6腎切除(5/6 subtotal nephrectomy STNx)模型，從整體、細胞和分子等不同水平，系統(tǒng)觀察了EMT 及其過程中JAK/STAT信號途徑的變化，以及血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑和補腎活血方劑的影響，以進一步探討EMT在慢性腎纖維化中的作用及其發(fā)病機制和防治措施。 方法 1．體外培養(yǎng)HKC細胞E

5、MT 及JAK/STAT 信號途徑的檢測HKC分成4組：LG組(5.5mmol/L葡萄糖)；LG+M組(5.5mmol/L葡萄糖+24.5mmol/L甘露醇)；HG組(30mmol/L葡萄糖)；HG+AG490組(30mmol/L葡萄糖+10μmol/L AG490)。分別在24孔板和25 cm<'2>塑料培養(yǎng)瓶內培養(yǎng)。培養(yǎng)6、12、24、48、72h后收集細胞，提取細胞總蛋白、RNA及采集細胞上清液。采用免疫沉淀和Western印跡檢

6、測JAK2磷酸化表達；免疫熒光細胞化學和Western blot檢測STAT1、STAT3、P-STAT1、P-STAT3、α-SMA和E-Cadherin等的表達；半定量RT-PCR檢測細胞TGF-β1mRNA的表達；酶聯(lián)免疫法檢測細胞上清液中I型膠原和TGF-β1 的分泌。 2.纈沙坦治療后HKC細胞EMT及JAK/STAT信號途徑變化的檢測HKC分成3組：LG組(5.5mmol/L葡萄糖)；HG組(30mmol/L葡萄糖)

7、；HG+Val組(30mmol/L葡萄糖+10μmol/L纈沙坦)。分別于刺激的6、12、24、48、72h后收集細胞，提取細胞總蛋白、RNA 及收集細胞上清液。采用免疫熒光細胞化學和Western blot檢測STAT1、STAT3、P-STATl、p-STAT3、α-SMA和E-Cadherin等的表達；免疫沉淀和Western印跡檢測JAK2磷酸化表達；半定量RT-PCR 檢測細胞TGF-β1mRNA的表達；酶聯(lián)免疫法檢測細胞上清

8、液中Ⅰ型膠原和TGF-β1的分泌。 3.氯沙坦治療后對STNx大鼠的 EMT 及J A K/S TA T信號途徑的檢測54只SD雄性大鼠隨機分為假手術組、STNx組和STNx+氯沙坦組，治療組每日給予氯沙坦20mg·Kg·d<'-1>灌胃，各組分別于2次手術后第4、8、12周各取6只大鼠，稱重后收集24h尿，測定尿蛋白(Upro)；取血測定尿素氮(BUN)和血肌酐(Scr)；取部分腎組織置于4％多聚甲醛固定用于光鏡觀察及免疫組化

9、檢測，部分腎皮質組織用于分離腎小管細胞，提取細胞總RNA和總蛋白。免疫組織化學染色法和Western blot檢測腎小球α-SMA、JAK2、STAT1、p-STAT1、STAT3和p-STAT3蛋白表達；免疫沉淀和Western blot檢測JAK2酪氨酸磷酸化；半定量RT-PCR 檢測腎小球TGF-β1mRNA、STAT1 mRNA和STAT3 mRNA表達。 4.補腎活血方劑治療后對STNx大鼠的EMT及JAK/STAT

10、信號途徑的檢測SD雄性大鼠隨機分成3組：假手術組(A)、STNx組(B)和STNx+補腎活血方劑治療組(C)。治療組每日給予中藥方劑20ml/kg灌胃。正常對照組和糖尿病組給予等量蒸餾水灌胃。于治療后4、8、12周收集血、尿和腎組織。部分腎組織經4％多聚甲醛固定形態(tài)學觀察和免疫組化。應用免疫組化、Western blot、免疫沉淀和Westem blot以及RT-PCR等方法，觀察對STNx大鼠腎小管上皮細胞JAK2、p-JAK2、 S

11、TAT1、p-STAT1、STAT3和 p-STAT3蛋白及 TGF-β1mRNA、STAT1 mRNA和STAT3mRNA表達的影響。 結果 1.JAK/STAT 信號途徑對高糖誘導的EMT的影響 ①免疫熒光細胞化學顯示，四種STAT信號蛋白在HKC細胞核和細胞漿均有表達。與低糖組比較，高糖組p-STAT1和 p-STAT3 表達增強，且增強部位為細胞核，提示活化后的STAT1和STAT3出現(xiàn)核轉移。AG490

12、處理組與高糖組相比，p-STAT1 和p-STAT3的表達明顯降低， STAT1和STAT3的核轉移減少。②與低糖組相比，高糖組HKC細胞JAK2磷酸化明顯增強(P<0.01)。AG490處理組JAK2磷酸化明顯被抑制(P<0.01)。③Western blot顯示，與同期低糖組相比，高糖組p-STAT1和p-STAT3表達明顯上調(P<0.01)。AG490處理組 p-STAT1和p-STAT3表達明顯下調(P<0.01)。 STAT

13、1和STAT3在各組表達無明顯差異。④免疫熒光細胞化學和western blot結果均顯示：高糖組隨刺激時間的延長，細胞內α-SMA 的表達明顯增強，E-Cadherin的表達明顯減弱；與高糖組比較，AG490組細胞內α-SMA 的表達明顯降低，E-Cadherin表達明顯升高。⑤TGF-β1 mRNA在低糖對照組有少量表達(0.21±0.04)，在高糖組TGF-β1 mRNA表達明顯上調(0.73±0.08)，和對照組相比差異顯著(P

14、<0.01)。AG490處理組細胞 TGF-β1 mRNA的表達明顯降低(0.49±0.07，P<0.01)。⑥高糖刺激HKC的上清液中 TGF-β1和Ⅰ型膠原分泌增加，與低糖對照組差異顯著(P<0.01)。AG490處理組細胞 TGF-β1和Ⅰ型膠原的分泌減少(與高糖組相比，P<0.01)。 2.纈沙坦通過JAK/STAT 途徑對高糖誘導的EMT 的影響 結論：①高糖能夠刺激HKC細胞TGF-β1mRNA表達升高；α-

15、SMA表達增強；細胞上清液中的TGF-β1、Ⅰ型膠原的分泌增多；表明高糖刺激能引起EMT的發(fā)生。與之同時，高糖還引起HKC細胞中信號蛋白JAK2、STAT1和STAT3的磷酸化增強；提示高糖可誘導JAK/STAT信號途徑的激活。JAK2特異性抑制劑AG490能夠降低高糖刺激引起STAT1和STAT3的磷酸化，抑制細胞TGF-β1mRNA和α-SMA 表達的升高，使上清中的TGF-β1、Ⅰ型膠原的含量減少。表明JAK/STAT 信號途徑參

16、與了高糖誘導的EMT的發(fā)生。②纈沙坦在一定程度上抑制了JAK/STAT信號途徑的活化，下調 TGF-β1mRNA 的表達，抑制高糖刺激引起的細胞 TGF-β1 及細胞外基質蛋白的分泌。提示纈沙坦的腎臟保護作用可能部分是通過抑制JAK/STAT 信號途徑實現(xiàn)的。③氯沙坦治療能夠明顯抑制STNx大鼠腎小管細胞中的信號蛋白JAK2、STAT1和STAT3的磷酸化，下調腎小管細胞 TGF-β1mRNA的表達，抑制EMT 的發(fā)生，減輕了腎小管細胞

17、的損傷，延緩了腎功能衰竭的發(fā)生，其腎臟保護作用可能部分是通過影響JAK/STAT 信號途徑活化及EMT 的進程而實現(xiàn)的。④補腎活血方劑能下調STNx大鼠腎小管細胞中STAT1和STAT3 mRNA的表達，明顯抑制信號蛋白JAK2、STAT1和STAT3的磷酸化，下調腎小管細胞TGF-β1mRNA的表達，明顯減少腎小管細胞α-SMA的表達，抑制EMT的發(fā)生，減輕了腎小管細胞的損傷，在一定程度上保護了腎功能。其腎臟保護機制仍有待進一步研究。