rhIL-24質(zhì)粒的構(gòu)建及rhDCN聯(lián)合rhIL-24對人外周血單個核細胞影響的體外研究.pdf

1、目的：探討核心蛋白聚糖(DCN)基因聯(lián)合白介素-24(IL-24)基因在體外對PBMC功能的影響。
　　 方法：⑴構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-DCN和pcDNA3.1(+)-IL-24。經(jīng)雙酶切、測序鑒定基因序列，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH-5α中，大量提取pcDNA3.1(+)-DCN和pcDNA3.1(+)-IL-24重組質(zhì)粒；⑵利用脂質(zhì)體2000將重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-DCN和pcDNA3.1(+)-IL

2、-24轉(zhuǎn)入PBMC，鑒定轉(zhuǎn)染效率，并通過RT-PCR檢測細胞內(nèi)DCN和IL-24的mRNA表達；⑶測定重組質(zhì)粒對PBMC的影響：MTT法檢測轉(zhuǎn)染后PBMC的增殖、ELISA測定轉(zhuǎn)染細胞IFN-r分泌水平、流式細胞技術(shù)(FCM)檢測PBMC表面PD-1的表達。
　　 結(jié)果：①構(gòu)建的質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ、NotⅠ雙酶切及PCR鑒定后，所得的基因片段與預(yù)期的基因片段大小相符；經(jīng)DNA測序證實：序列與GenBank中IL-24的序列一致；②

3、通過脂質(zhì)體2000將重組質(zhì)轉(zhuǎn)入PBMC后，熒光顯微鏡下可見細胞內(nèi)綠色熒光的表達；RT-PCR檢測到細胞內(nèi)有DCN和IL-24的mRNA表達；③MTT法檢測細胞增殖：轉(zhuǎn)染后96h、120h、144h，DCN與IL-24聯(lián)合組的細胞增殖率明顯高于DCN組，IL-24組，空質(zhì)粒組，空白對照組，脂質(zhì)體組；ELISA顯示：DCN與IL-24聯(lián)合組分泌IFN-γ的量顯著高于其他組，有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)；流式細胞技術(shù)(FCM)顯示：PD-1受