魚鰾作為新型心血管外科手術(shù)生物材料的試驗研究.pdf

1、生物材料(Biomaterials)已在心血管外科領(lǐng)域得到廣泛使用,其中又以生物心臟瓣膜和人工血管使用較多。生物瓣膜因血流動力學出色、血栓栓塞發(fā)生率低、術(shù)后生活質(zhì)量高等優(yōu)點,尤其在發(fā)達國家已有較高的認可度,但由于牛心包等異種材料本身原因,早期即可能出現(xiàn)機械性毀損和鈣化衰敗,大大限制了生物瓣膜的適用范圍。大口徑人工血管已成功應(yīng)用于心血管手術(shù)且術(shù)后效果好,而小口徑人工血管(口徑＜6mm)因血液相容性差導致的術(shù)后通暢率低等原因,仍未獲得臨床認

2、可。因此,目前人們正在努力通過對現(xiàn)有材料加工改性及尋找新材料的角度出發(fā)以期解決以上問題。由此目的出發(fā),本文分別從物理性能、體外生物相容性及動物實驗三個不同層面深入研究魚鰾性質(zhì),旨在尋求一種優(yōu)于目前臨床常用材料的新型心血管外科生物材料。
　　 第一部分魚鰾的物理性能試驗研究
　　 目的:研究魚鰾各項生物力學性能和熱穩(wěn)定性,以及交聯(lián)處理（0.625％戊二醛溶液）對其性能的影響。
　　 方法:1、通過單軸拉伸試驗(Un

3、iaxial Tensile Test)獲得被測材料拉伸至毀損時的極限阿爾曼西應(yīng)變（Failure Almansi strain,εf）、極限柯西應(yīng)力(Failure Cauchy stress,σf)以及極限彈性模量(Peak Elastic Modulus,Mp),比較新鮮、戊二醛處理后的魚鰾在不同方向上和牛心包的力學差異。結(jié)合預(yù)試驗中維多利亞藍-苦味酸酸性復紅染色(Victoria blue-van Gieson,VG)染色、透射

4、電鏡觀察以及本試驗結(jié)果,對纖維排列做出描述。2、通過差示量熱掃描技術(shù)（Differential Scanning Calorimetry,DSC）檢測新鮮和戊二醛處理后魚鰾的熱變性溫度并分析交聯(lián)處理對其熱穩(wěn)定性的影響。
　　 結(jié)果:1、單軸拉伸試驗:(1)無論新鮮或是戊二醛交聯(lián)后魚鰾在周向的三個力學結(jié)果均高于縱向。(2)戊二醛處理后魚鰾周向的σf、 Mp均高于同方向的新鮮魚鰾,兩者εf無顯著統(tǒng)計學差異。(3)戊二醛交聯(lián)后魚鰾縱向

5、εf大于同方向新鮮魚鰾,兩者σf、Mp無顯著統(tǒng)計學差異。(4)戊二醛處理后牛心包σf、 Mp均高于新鮮牛心包,兩者εf無統(tǒng)計學差異。(5)兩材料經(jīng)戊二醛處理后,魚鰾周向及縱向σf、 Mp均低于牛心包,εf顯著高于牛心包。2、差示量熱掃描:新鮮魚鰾熱變性溫度高于正常人體溫范圍,且戊二醛處理后魚鰾熱穩(wěn)定性優(yōu)于新鮮時。
　　 結(jié)論:1、魚鰾纖維排列較牛心包規(guī)則,膠原纖維主要沿周向排列,彈力纖維在周向及縱向均有分布。2、戊二醛處理后魚鰾

6、僵硬度（Stiffness）低于牛心包,延展性優(yōu)于牛心包,更接近人正常主動脈瓣膜力學范圍。3、魚鰾,尤其經(jīng)過戊二醛處理后,熱穩(wěn)定性可達到體溫要求。
　　 第二部分魚鰾生物相容性體外試驗評價
　　 目的:根據(jù)國際ISO10993醫(yī)療器械生物學評價指南研究魚鰾體外細胞毒性及血液相容性。
　　 方法:1、體外細胞毒性試驗:用含10％胎牛血清的MEM培養(yǎng)液浸提新鮮魚鰾,采用MTT法檢測浸提液對小鼠成纖維細胞L929的細胞

7、毒性作用。2、體外血小板激活試驗:用人全血浸提魚鰾,通過CD62p檢測法計算活化血小板數(shù)量。3、體外溶血試驗:用無菌生理鹽水浸提魚鰾,采用游離血紅蛋白直接測定法檢測浸提液與人血混合后的游離血紅蛋白含量并計算溶血率。以上試驗均以牛心包材料作為試驗對照組。
　　 結(jié)果:1、100％新鮮魚鰾和100％新鮮牛心包浸提液接觸后的L929細胞活力分別為85.7％和94.2％,可認為兩材料對L929細胞無毒性影響。2、戊二醛處理后魚鰾和牛心包

8、組CD62P百分率分別為0.94±0.27％和1.73±0.35％,可認為兩材料均對體外人血血栓形成沒有影響。3、戊二醛處理后魚鰾和牛心包組溶血率分別為0.2％和0.6％,可認為兩材料對體外溶血沒有影響。
　　 結(jié)論:魚鰾材料在體外細胞毒性檢測和體外血液相容性檢測中表現(xiàn)出良好的生物相容性并為進一步動物試驗提供理論基礎(chǔ)。
　　 第三部分魚鰾體內(nèi)鈣化研究
　　 目的:采用大鼠背部皮下埋植模型,定性及定量評估魚鰾不同時

9、間點鈣化程度,并與牛心包進行對比。
　　 方法:1、采用已在牛心包中驗證有效的DSC(Denaturant-surfactant-crosslinking)抗鈣化方法（美國Edwards公司專利,Patent No.:US6214054B1）預(yù)處理魚鰾及牛心包材料,行幼年大鼠背部皮下埋植,于術(shù)后7天、21天、56天取出樣本,定性及定量檢測鈣化情況并明確與免疫反應(yīng)的關(guān)系。2、鈣定性檢測:采用X線攝影、HE染色、VG染色及Von K

10、ossa染色從樣本形態(tài)學和組織學水平評價各時間點鈣鹽沉積情況。3、鈣定量測定:采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(Indutive Coupled Plasma EmissionSpectrimeter, ICP)對比分析樣本鈣含量。4、免疫組織化學:CD68+巨噬細胞及CD8+T細胞特異性免疫組化染色研究材料內(nèi)部炎性細胞浸潤情況,并與鈣化程度關(guān)聯(lián)。
　　 結(jié)果:1、魚鰾各期鈣化程度均低于牛心包,魚鰾纖維完整排列有序,僅在后期局部鈣

11、化處發(fā)生纖維斷裂,牛心包早期出現(xiàn)鈣鹽沉積,纖維破壞嚴重。定量測定表明牛心包各期鈣含量高于魚鰾組,以21天時差異最顯著。2、免疫組化染色顯示各時期魚鰾內(nèi)部未見炎性細胞浸潤,而牛心包各期均有CD68+巨噬細胞及CD8+T細胞浸入。
　　 結(jié)論:大鼠皮下埋植鈣化模型顯示經(jīng)戊二醛-DSC抗鈣化方法處理后魚鰾各期鈣化程度顯著低于牛心包,魚鰾在體內(nèi)具有更出色的抗鈣化性能。
　　 第四部分新型材料小口徑人造血管的試驗研究
　　

12、 目的:采用大鼠腹主動脈置換模型評估魚鰾作為小口徑人造血管材料的效果,并與牛心包相比較,進一步評估兩者的血液相容性。
　　 方法:根據(jù)ISO10993指南,使用魚鰾和牛心包材料制作小口徑人造血管并行大鼠腹主動脈置換,于30天及60天取出并觀察如下指標。1、通暢率及血管瘤觀察:采用320排CT掃描并三維成像觀察通暢率及血管瘤形成。2、內(nèi)皮化及新生內(nèi)膜觀察:采用掃面電鏡直觀觀察內(nèi)皮細胞黏附,采用HE、VG染色觀察通暢血管管壁纖維排列

13、及彈力纖維增生,采用第八因子相關(guān)抗原及α-SMA免疫組化染色觀察人造血管各期纖維排列、內(nèi)皮化及平滑肌細胞增生程度。3、鈣化研究:采用X線體外攝影及離體樣本Micro CT掃描初步評估血管壁鈣鹽沉積,采用組織切片Von Kossa染色鏡下進一步觀察鈣鹽沉積情況。
　　 結(jié)果:1、各期魚鰾人造血管通暢率均為100％,牛心包人造血管均為16.67％。通暢血管均未見血管瘤形成。2、通暢血管各期纖維排列有序,僅60天牛心包血管可見纖維破壞

14、斷裂,兩者通暢血管均可見彈力纖維覆蓋,魚鰾血管中彈力纖維更豐富;魚鰾內(nèi)皮化與牛心包比較速度更快程度更完整;兩材料吻合口處均可見平滑肌細胞增生,30天及60天魚鰾內(nèi)膜厚度無明顯差異,30天時牛心包內(nèi)膜增生較魚鰾顯著,60天時牛心包內(nèi)膜幾乎堵塞管腔。3、X線體外攝影及離體樣本Micro CT掃描均未發(fā)現(xiàn)血管中明顯鈣化點,經(jīng)組織切片Von kossa染色顯示,僅60天時牛心包血管材料管壁可見鈣鹽點狀沉積并致纖維斷裂,其余時期兩者通暢血管中均未

15、見鈣鹽沉積。
　　 結(jié)論:魚鰾材料血液相容性優(yōu)于牛心包,可以作為小口徑人造血管材料。
　　 全文總結(jié):
　　 本課題研究表明,鯉魚鰾最大斷裂強度低于牛心包,延展性及柔韌性優(yōu)于牛心包,熱穩(wěn)定性能達到人體內(nèi)使用要求。魚鰾生物相容性優(yōu)良,無細胞毒性、致血栓形成及致溶血的性質(zhì)。大鼠皮下埋植模型結(jié)果表明,經(jīng)抗鈣化處理后,鈣化率顯著低于牛心包。魚鰾小口徑人造血管行大鼠腹主動脈置換結(jié)果表明,魚鰾材料作為人造血管,血液相容性滿意