熱休克蛋白60在凋亡細胞和大腸桿菌的表面表達及意義研究.pdf

1、第一部分通過非經典分泌途徑在真核細胞表面表達損傷相關模式分子
　　 損傷相關模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)分子是指細胞損傷或激活后釋放的多種具有免疫調節(jié)活性的細胞內分子可能是許多慢性非感染性炎癥疾病包括自身免疫病、關節(jié)炎、腫瘤、動脈粥樣硬化等的內源性致病因素。生理狀態(tài)下，DAMPs分子大多存在于細胞內作為轉錄調控因子、分子伴侶或分子馬達維持細胞正常功能或作為細胞代謝產

2、物被機體迅速清除。病理狀態(tài)下，DAMPs分子可通過主動或被動方式釋放到細胞膜或者細胞外間質，發(fā)揮免疫調節(jié)作用。然而目前細胞膜上的DAMPs確切的生物學功能尚不明確，因此需要建立一種能夠有效地將DAMPs分子表達于細胞膜的方法。
　　 本部分的研究首次發(fā)現(xiàn)利用利氏曼原蟲HASPB蛋白的N端非經典分泌信號肽HASPB-N18能夠有效地將HSP60、HSP70和HMGB1等DAMPs分子表達到細胞膜上，并且這種方法廣泛適用于多種真核細

3、胞系。此外，我們的實驗證實利用HASPB-N18信號肽表達于細胞膜上的HSP60能夠被其可溶性受體LOX-1識別，說明這些分子在轉運的過程中保持了正確的蛋白質構象。
　　 綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了一種能夠有效地將DAMPs分子表達于細胞膜上的方法，該方法廣泛適用于多種真核細胞系。這種方法的建立有利于進一步研究在炎癥損傷過程中，易位表達于細胞膜上的DAMPs分子的生物學功能。
　　 第二部分表面熱休克蛋白促進凋亡細胞清除及相

4、關抗原提呈
　　 熱休克蛋白(heat shockproteins，HSPs)又稱應激蛋白(stress proteins)，是機體細胞在一些應激原如環(huán)境高溫、缺氧、氧化應激、代謝毒物等條件誘導下，激活HSPs基因，高效表達的一組蛋白質。HSPs在體內可與多種蛋白質形成復合體，陪伴蛋白分子在細胞內轉運、跨膜，參與蛋白質的折疊與伸展、多聚復合體的組裝，發(fā)揮其調節(jié)靶蛋白的作用，但又不改變靶蛋白的結構，故HSPs又被稱作“分子伴侶”。

5、在不同應激的刺激下，多種HSPs會從胞內易位表達至細胞膜或者釋放到胞外。
　　 我們的研究發(fā)現(xiàn)，多種哺乳動物細胞在UV照射或順鉑導致的凋亡發(fā)生早期，細胞內的HSP60、HSP70和HSP90會迅速易位表達至細胞膜，這個過程發(fā)生在磷脂酰絲氨酸(PtdSer)外翻之前。進一步的實驗證實，凋亡細胞表面的HSP60、HSP70和HSP90促進小鼠骨髓來源的樹突細胞(BMDC)釋放IL-1β和IL-6等促炎因子，并促進BMDC成熟。此外，

6、我們還發(fā)現(xiàn)包被HSP60、HSP70和HSP90的乳膠微珠能夠被BMDC清除，并且表面過表達這三種HSPs的凋亡細胞被BMDC的清除效率顯著增高。表達于BMDC表面的LOX-1是HSP60、HSP70和HSP90的共同受體，三者促進凋亡細胞清除以及促進凋亡細胞抗原提呈的功能都由LOX-1參與調節(jié)。
　　 綜上所述，我們的研究表明表達在凋亡細胞表面的HSP60、HSP70和HSP90具有雙重功能：一方面參與調節(jié)BMDC與凋亡細胞的

7、識別，促進吞噬；另一方面還能加速BMDC成熟，促進凋亡細胞相關抗原的交叉提呈。
　　 第三部分大腸桿菌表面的GroEL通過LOX-1促進巨噬細胞清除細菌
　　 細菌性腹膜炎是腹部手術、創(chuàng)傷或腹腔感染的常見并發(fā)癥，目前對人類健康危害極大。大腸桿菌是臨床上引起細菌性腹膜炎的主要致病菌。侵入腹腔的大腸菌是如何激活免疫應答，進而誘導炎癥產生的機制仍不明確。在大腸桿菌的表面表達的很多蛋白能夠被其表達在宿主巨噬細胞表面的受體識別，參

8、與調節(jié)了大腸桿菌對巨噬細胞的附著和入侵。發(fā)現(xiàn)這些與大腸桿菌粘附巨噬細胞密切相關的因子并闡明其作用機制對于提出新的感染治療方法具有重要的意義。HSP60是生物體內高度保守的一類蛋白，大腸桿菌的HSP60被稱為GroEL。以前的觀點認為GroEL在細菌中作為分子伴侶，與GroES能夠共同幫助細菌內多種蛋白完成裝配，并形成正確的折疊，使其具有完整的功能。然而在溫度升高，營養(yǎng)不足，氧化等外界應激條件的刺激下，GroEL表達上升，對于細菌的生存有

9、積極的保護意義。
　　 在實驗中，我們首次發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的外膜表面表達GroEL蛋白，而且在熱休克的情況下，表面GroEL表達上升。為了闡明表面GroEL的生物學意義，我們構建了一株外膜過表達GroEL的新的大腸桿菌菌株。通過吞噬實驗，我們發(fā)現(xiàn)表面過表達GroEL的大腸桿菌能更有效的被巨噬細胞清除，進一步的實驗證明，GroEL這一生物學功能是受到巨噬細胞表面其受體LOX-1調節(jié)的，并且GroEL刺激能夠上調巨噬細胞表面LOX-1的