熱休克蛋白60在凋亡細(xì)胞和大腸桿菌的表面表達(dá)及意義研究.pdf

1、第一部分通過非經(jīng)典分泌途徑在真核細(xì)胞表面表達(dá)損傷相關(guān)模式分子
　　 損傷相關(guān)模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)分子是指細(xì)胞損傷或激活后釋放的多種具有免疫調(diào)節(jié)活性的細(xì)胞內(nèi)分子可能是許多慢性非感染性炎癥疾病包括自身免疫病、關(guān)節(jié)炎、腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化等的內(nèi)源性致病因素。生理狀態(tài)下，DAMPs分子大多存在于細(xì)胞內(nèi)作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、分子伴侶或分子馬達(dá)維持細(xì)胞正常功能或作為細(xì)胞代謝產(chǎn)

2、物被機(jī)體迅速清除。病理狀態(tài)下，DAMPs分子可通過主動(dòng)或被動(dòng)方式釋放到細(xì)胞膜或者細(xì)胞外間質(zhì)，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。然而目前細(xì)胞膜上的DAMPs確切的生物學(xué)功能尚不明確，因此需要建立一種能夠有效地將DAMPs分子表達(dá)于細(xì)胞膜的方法。
　　 本部分的研究首次發(fā)現(xiàn)利用利氏曼原蟲HASPB蛋白的N端非經(jīng)典分泌信號(hào)肽HASPB-N18能夠有效地將HSP60、HSP70和HMGB1等DAMPs分子表達(dá)到細(xì)胞膜上，并且這種方法廣泛適用于多種真核細(xì)

3、胞系。此外，我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)利用HASPB-N18信號(hào)肽表達(dá)于細(xì)胞膜上的HSP60能夠被其可溶性受體LOX-1識(shí)別，說明這些分子在轉(zhuǎn)運(yùn)的過程中保持了正確的蛋白質(zhì)構(gòu)象。
　　 綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了一種能夠有效地將DAMPs分子表達(dá)于細(xì)胞膜上的方法，該方法廣泛適用于多種真核細(xì)胞系。這種方法的建立有利于進(jìn)一步研究在炎癥損傷過程中，易位表達(dá)于細(xì)胞膜上的DAMPs分子的生物學(xué)功能。
　　 第二部分表面熱休克蛋白促進(jìn)凋亡細(xì)胞清除及相

4、關(guān)抗原提呈
　　 熱休克蛋白(heat shockproteins，HSPs)又稱應(yīng)激蛋白(stress proteins)，是機(jī)體細(xì)胞在一些應(yīng)激原如環(huán)境高溫、缺氧、氧化應(yīng)激、代謝毒物等條件誘導(dǎo)下，激活HSPs基因，高效表達(dá)的一組蛋白質(zhì)。HSPs在體內(nèi)可與多種蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，陪伴蛋白分子在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、跨膜，參與蛋白質(zhì)的折疊與伸展、多聚復(fù)合體的組裝，發(fā)揮其調(diào)節(jié)靶蛋白的作用，但又不改變靶蛋白的結(jié)構(gòu)，故HSPs又被稱作“分子伴侶”。

5、在不同應(yīng)激的刺激下，多種HSPs會(huì)從胞內(nèi)易位表達(dá)至細(xì)胞膜或者釋放到胞外。
　　 我們的研究發(fā)現(xiàn)，多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞在UV照射或順鉑導(dǎo)致的凋亡發(fā)生早期，細(xì)胞內(nèi)的HSP60、HSP70和HSP90會(huì)迅速易位表達(dá)至細(xì)胞膜，這個(gè)過程發(fā)生在磷脂酰絲氨酸(PtdSer)外翻之前。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，凋亡細(xì)胞表面的HSP60、HSP70和HSP90促進(jìn)小鼠骨髓來源的樹突細(xì)胞(BMDC)釋放IL-1β和IL-6等促炎因子，并促進(jìn)BMDC成熟。此外，

6、我們還發(fā)現(xiàn)包被HSP60、HSP70和HSP90的乳膠微珠能夠被BMDC清除，并且表面過表達(dá)這三種HSPs的凋亡細(xì)胞被BMDC的清除效率顯著增高。表達(dá)于BMDC表面的LOX-1是HSP60、HSP70和HSP90的共同受體，三者促進(jìn)凋亡細(xì)胞清除以及促進(jìn)凋亡細(xì)胞抗原提呈的功能都由LOX-1參與調(diào)節(jié)。
　　 綜上所述，我們的研究表明表達(dá)在凋亡細(xì)胞表面的HSP60、HSP70和HSP90具有雙重功能：一方面參與調(diào)節(jié)BMDC與凋亡細(xì)胞的

7、識(shí)別，促進(jìn)吞噬；另一方面還能加速BMDC成熟，促進(jìn)凋亡細(xì)胞相關(guān)抗原的交叉提呈。
　　 第三部分大腸桿菌表面的GroEL通過LOX-1促進(jìn)巨噬細(xì)胞清除細(xì)菌
　　 細(xì)菌性腹膜炎是腹部手術(shù)、創(chuàng)傷或腹腔感染的常見并發(fā)癥，目前對(duì)人類健康危害極大。大腸桿菌是臨床上引起細(xì)菌性腹膜炎的主要致病菌。侵入腹腔的大腸菌是如何激活免疫應(yīng)答，進(jìn)而誘導(dǎo)炎癥產(chǎn)生的機(jī)制仍不明確。在大腸桿菌的表面表達(dá)的很多蛋白能夠被其表達(dá)在宿主巨噬細(xì)胞表面的受體識(shí)別，參

8、與調(diào)節(jié)了大腸桿菌對(duì)巨噬細(xì)胞的附著和入侵。發(fā)現(xiàn)這些與大腸桿菌粘附巨噬細(xì)胞密切相關(guān)的因子并闡明其作用機(jī)制對(duì)于提出新的感染治療方法具有重要的意義。HSP60是生物體內(nèi)高度保守的一類蛋白，大腸桿菌的HSP60被稱為GroEL。以前的觀點(diǎn)認(rèn)為GroEL在細(xì)菌中作為分子伴侶，與GroES能夠共同幫助細(xì)菌內(nèi)多種蛋白完成裝配，并形成正確的折疊，使其具有完整的功能。然而在溫度升高，營養(yǎng)不足，氧化等外界應(yīng)激條件的刺激下，GroEL表達(dá)上升，對(duì)于細(xì)菌的生存有

9、積極的保護(hù)意義。
　　 在實(shí)驗(yàn)中，我們首次發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的外膜表面表達(dá)GroEL蛋白，而且在熱休克的情況下，表面GroEL表達(dá)上升。為了闡明表面GroEL的生物學(xué)意義，我們構(gòu)建了一株外膜過表達(dá)GroEL的新的大腸桿菌菌株。通過吞噬實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)表面過表達(dá)GroEL的大腸桿菌能更有效的被巨噬細(xì)胞清除，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明，GroEL這一生物學(xué)功能是受到巨噬細(xì)胞表面其受體LOX-1調(diào)節(jié)的，并且GroEL刺激能夠上調(diào)巨噬細(xì)胞表面LOX-1的