加味桃核承氣湯不同配伍組方及提取方法對糖尿病血管平滑肌細(xì)胞增殖、凋亡的影響.pdf

1、本研究回顧了近20年來傷寒方及《傷寒論》名方“桃核承氣湯”在DM 及其并發(fā)癥防治方面的臨床及實驗研究成果；綜述了中、西醫(yī)抗糖尿病ACVD的臨床及實驗研究；闡明了糖尿病ACVD 與糖尿病血管平滑肌細(xì)胞(vascularsmooth muscle cell，VSMC)增殖、凋亡的相關(guān)性；總結(jié)了中、西醫(yī)對糖尿病VSMC增殖、凋亡的研究成果；探討了體外培養(yǎng)細(xì)胞中藥血清藥理學(xué)研究的若干問題。同時，立足于加味桃核承氣湯治療DM及其ACVD并發(fā)癥的實

2、驗及臨床研究成果，以中藥復(fù)方含藥血清研究及細(xì)胞培養(yǎng)方法，運用四甲基偶氮唑鹽比色法 (methy thiazolyltetrazolium，MIT)及流式細(xì)胞儀 (flow cytometer，F(xiàn)CM)、透射電鏡等技術(shù)，觀察加味桃核承氣湯不同配伍組方及提取方法對糖尿病血管平滑肌細(xì)胞增殖、凋亡的影響。 1 理論與文獻(xiàn)研究 療效確切、配伍合理、藥物精少的《傷寒論》經(jīng)方，是進(jìn)行中藥復(fù)方實驗研究的首選對象，其成果可作為研究其他方劑

3、的基礎(chǔ)。經(jīng)方防治 DM 并發(fā)癥的臨床和實驗研究有限，但填補了經(jīng)方治療 DM 并發(fā)癥基礎(chǔ)研究的部分空白，證實了部分傷寒方對于防治DM及其并發(fā)癥確有成效，揭示了臨床上治療 DM 并發(fā)癥常用經(jīng)方部分作用機制，并且初步明確部分經(jīng)方防治DM并發(fā)癥的有效組分(不同的中藥治法配伍組)。研究經(jīng)方防治DM并發(fā)癥，是中藥復(fù)方研究本病的突破口之一，重視拆方研究、重視藥動學(xué)、方與證相結(jié)合可能是今后的研究思路。 《傷寒論》名方“桃核承氣湯”在DM及其并發(fā)

4、癥的防治方面，臨床及實驗研究己取得不少成果，總結(jié)了臨床療效，揭示了部分作用機制，初步明確了其防治DM及其并發(fā)癥的部分有效組分。 多種因素如遺傳、內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、脂質(zhì)代謝異常及VSMC功能異常、免疫復(fù)合物的形成、血栓形成等，在糖尿病ACVD發(fā)生中起重要作用。糖尿病，尤其是2型，其長期慢性的血管內(nèi)皮低度炎癥，可促進(jìn)VSMC增殖，抑制其凋亡，而導(dǎo)致大血管并發(fā)癥如動脈粥樣硬化，因此，糖尿病ACVD與糖尿病VSMC增殖、凋亡密切相關(guān)。中

5、醫(yī)研究則發(fā)現(xiàn)，確診的心血管疾病合并DM患者，其60-90％患者有血瘀證候。西藥噻唑烷二酮類化合物(Thiazoliddinediones，TZDs)、胰島素 (regularinsulin，RI)、二甲雙胍不僅可以降低血糖，還可以發(fā)揮抗炎及抗動脈粥樣硬化的作用；而治療心血管疾病的常用藥物他汀類調(diào)脂藥、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin-converting-enyme inhibitor，ACEI)、血管緊張素受體阻滯劑(a

6、ngiotensin receptor blockers，ARBs)、阿司匹林，通過發(fā)揮抗炎作用也可以改善2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)，為糖尿病ACVD的治療提供了廣闊的前景。干細(xì)胞移植術(shù)在糖尿病及其ACVD并發(fā)癥的治療也在探索中。中醫(yī)或辨證論治，或?qū)２７?，或分病辨證，明顯改善了患者的血液流變學(xué)異常程度及臨床癥狀。部分中藥可防治糖尿病ACVD，而影響糖尿病VSMC增殖、凋亡，可能是其抗動脈硬

7、化的作用機制之一。 2 實驗研究: 2.1 目的: 觀察加味桃核承氣湯不同配伍組方及提取方法對DM血管平滑肌細(xì)胞 (vascularsmooth muscle cell，VSMC)增殖、凋亡的影響，以期優(yōu)化配伍組方、初步篩選抗DM心血管病變有效成份，闡明《傷寒論》經(jīng)典方劑桃核承氣湯防治糖尿病ACVD的理論與臨床的實驗依據(jù)。 2.2 方法: 本研究依托廣東省自然科學(xué)基金項目“加味桃核承氣湯組方配伍及

8、成分抗糖尿病血管病變的研究”(編號：31477)前期研究成果，采用中國基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心兔主動脈平滑肌細(xì)胞株，培養(yǎng)、凍存與傳代，使用第16代細(xì)胞傳代至第21代用于實驗，以西藥羅格列酮、美迪康作為對照，觀察加味桃核承氣湯不同配伍組方及提取方法對糖尿病VSMC增殖、凋亡的影響。實驗分為三個階段：第一階段培養(yǎng)實驗用 VSMC；第二階段采用SD單性別(雄性)大鼠作為研究對象，制備大鼠空白血清及含藥血清；第三階段進(jìn)行糖尿病VSMC損傷造模；第四階段

9、以MTT法、流式細(xì)胞儀及透射電鏡觀察加味桃核承氣湯不同配伍組方及提取方法對VSMC增殖、凋亡的影響，比較各組作用差異。 2.3 結(jié)果: 本研究成功培養(yǎng)、凍存與傳代家兔主動脈VSMC；采用SD 單性別(雄性)大鼠作為研究對象，以大鼠空白血清對VSMC的毒性確定稀釋度為5，即含藥血清的添加比例為20％；不同劑量組含藥血清對VSMC的影響研究結(jié)果確定中劑量組較為適宜； 結(jié)合體表面積法，計算大鼠的藥物灌胃量為等效劑量；腹

10、主動脈采血分離血清，預(yù)實驗及正式實驗大鼠含藥血清均一次性成功制備；研究不同濃度RI對VSMC增殖的影響證實，高RI 濃度可以促進(jìn)VSMC 的增殖，發(fā)現(xiàn)3000mu/L RI組無明顯誘導(dǎo)VSMC增殖作用，30mu/L及 300mu/L RI 組均有誘導(dǎo)VSMC增殖作用，但300mu/L RI 組增殖率更高，確定添加RI終濃度為300mu/L。以MTT法、流式細(xì)胞儀、透射電鏡觀察加味桃核承氣湯不同配伍組方及提取方法對 VSMC增殖、凋亡的影

11、響顯示，MTT、法發(fā)現(xiàn)，空白組及活血+瀉熱通下組加藥前后無顯著性差異。加藥后各組間比較顯示，模型組較空白組增殖作用顯著(P<0.01)，表明RI誘導(dǎo)SMC增殖是成功的。不同配伍方面，羅格列酮組、加味桃核承氣湯全方組、活血組、活血+瀉熱通下組均具有胰島素誘導(dǎo)的VSMC增殖抑制作用。其中，活血+瀉熱通下組抑制率最高。不同提取方法方面，水提醇沉組，乙酸乙酯組及正丁醇組均具有顯著的糖尿病VSMC增殖抑制作用，而以正丁醇組的增殖抑制率最高。

12、 FCM 結(jié)果表明：胰島素能促進(jìn) VSMC 增殖并抑制其凋亡，但與空白血清比較，其G0/G1期、S期、G2M期DNA含量均無顯著性差異，機理有待進(jìn)一步研究。 同模型組相比，羅格列酮組及中藥各組促進(jìn)凋亡作用均顯著(P<0.01)，但同加味桃核承氣湯全方組相比，羅格列酮組、活血組、活血+瀉熱通下組、乙酸乙酯組促進(jìn)凋亡作用更為顯著(P<0.01)。促進(jìn)糖尿病VSMC凋亡的藥物有效成分，更大的可能存在于這4組當(dāng)中。在促進(jìn)糖尿病VSCM

13、凋亡的機制方面，羅格列酮組可能與G0/G1、G2M 期阻滯有關(guān)；活血+瀉熱通下組活血組可能與 G2M 期阻滯有關(guān)；乙酸乙酯組可能與G0/G1、G2M 期阻滯有關(guān)。 電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，正常培養(yǎng)的VSMC細(xì)胞，染色質(zhì)分布均勻，細(xì)胞質(zhì)富含線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體，細(xì)胞膜完整，微絨毛豐富，也可見細(xì)胞核核膜消失，核中染色質(zhì)密集，電子密度增高，成小斑塊狀，為處于分裂、增殖的細(xì)胞。凋亡細(xì)胞電鏡下可見染色質(zhì)濃縮成半月形，胞膜空泡化，細(xì)胞固縮，染色質(zhì)邊

14、集，可見凋亡小體。結(jié)果顯示，空白對照組、模型組、美迪康組、益氣養(yǎng)陰組未見明顯凋亡小體；羅格列酮組、加味桃核承氣湯組、活血組、瀉熱通下組、活血+瀉熱通下組、水提醇沉組、乙酸乙酯組及正丁醇組可見程度不等的細(xì)胞凋亡，部分可見明顯的凋亡小體。線粒體變化方面，空白對照組、美迪康組、益氣養(yǎng)陰組線粒體數(shù)量正常，形態(tài)及嵴結(jié)構(gòu)大致正常；模型組線粒體增多，嵴結(jié)構(gòu)清晰；羅格列酮組、加味桃核承氣湯組、活血組、瀉熱通下組、活血+瀉熱通下組、水提醇沉組、乙酸乙酯組

15、及正丁醇組線粒體數(shù)量減少、嵴結(jié)構(gòu)模糊。其抗糖尿病ACVD的主要成份，可能存在于除益氣養(yǎng)陰組外的各配伍組當(dāng)中及水提醇沉組、乙酸乙酯組、正丁醇組各組提取組中，羅格列酮組亦有相似的改變。從促進(jìn)VSMC凋亡程度來看，羅格列酮組、活血組、活血+瀉熱通下組、乙酸乙酯組及正丁醇組更加顯著。 2.4 結(jié)論: 加味桃核承氣湯對糖尿病VSMC的增殖抑制及促進(jìn)凋亡可能是發(fā)揮其抗糖尿病ACVD作用的途徑之一；其抗糖尿病ACVD的主要成份可能存在

16、于活血組及活血+瀉熱通下組中；乙酸乙酯組、正丁醇組中可能含有較多的抗糖尿病AVCD的有效成份。羅格列酮組亦有這方面的作用。在抑制糖尿病VSCM增殖并促進(jìn)其凋亡的機制方面，羅格列酮組可能與G0/G1、G2M期阻滯有關(guān)；活血+瀉熱通下組、活血組可能與G2M期阻滯有關(guān)；乙酸乙酯組可能與G0/G1、G2M期阻滯有關(guān)：正丁醇組可能與S期、G2M期阻滯有關(guān)。 3 創(chuàng)新點: 3.1 對傷寒學(xué)發(fā)展的有益探索和創(chuàng)新本研究堅持中醫(yī)藥理論為指

17、導(dǎo)，方證結(jié)合，方病結(jié)合，整體地研究《傷寒論》經(jīng)方，從血管平滑肌細(xì)胞增殖與凋亡一動脈粥樣硬化一糖尿病動脈硬化性心血管疾病的密切關(guān)聯(lián)出發(fā)，應(yīng)用拆方理論及不同提取方法研究經(jīng)方復(fù)方，是對傷寒學(xué)科學(xué)術(shù)發(fā)展的有益探索和創(chuàng)新，為經(jīng)方的現(xiàn)代化應(yīng)用和研究提供了新的思路。 3.2 初步闡明加昧桃核承氣湯不同配伍組方及提取方法影響糖尿病VSMC增殖及凋亡的作用途徑及物質(zhì)基礎(chǔ)通過對不同配伍組方及提取方法血清藥理學(xué)比較研究，初步闡明加味桃核承氣湯治療糖尿