p38激酶-Caldesmon途徑介導(dǎo)燒傷血清誘導(dǎo)的血管通透性增加及其機(jī)制研究.pdf

1、血管通透性增高是燒傷早期體液丟失，引發(fā)休克和早期全身缺氧性損害的根本原因，其本質(zhì)是血管內(nèi)皮通透性的增高。由于其機(jī)制一直沒有充分闡明，臨床上針對燒傷的治療，尚未找到能降低通透性和減少燒傷輸液的有效措施。相對于穿細(xì)胞途徑，內(nèi)皮細(xì)胞旁途徑是燒傷后血管內(nèi)皮通透性增高的主要途徑。 研究表明，血管通透性變化與調(diào)節(jié)涉及細(xì)胞骨架重組、粘附連接、緊密連接結(jié)構(gòu)與功能改變等不同的機(jī)制。內(nèi)皮細(xì)胞收縮性改變是不同原兇引起通透性增加的共同通路，主要受骨架蛋

2、白中肌球蛋白和肌動蛋白的影響。 p38激酶可能在細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)所致的內(nèi)皮通透性增高中起著重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，p38 MAPK通過磷酸化下游靶蛋白來調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能。目前已發(fā)現(xiàn)p38MAPK有5個(gè)異構(gòu)體，激酶分析顯示p38α是最主要的活性形式，在炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。 鈣調(diào)素結(jié)合蛋白(Caldesmon)分為高分子量Caldesmon(h-Caldesmon)和低分子量Caldesmon(1-Caldesmon)。兩者是

3、同一基因的不同拼接型，結(jié)構(gòu)相似。1-Caldesmon可以和維狀肌動蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白、鈣調(diào)素相結(jié)合。1-Caldesmon在調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的動態(tài)平衡中起著重要作用，1-Caldesmon的功能變化在內(nèi)皮細(xì)胞高通透性中扮演了重要角色。 一、研究目的 探討p38激酶和Caldesmon在燒傷早期血管通透性變化中的調(diào)控作用和機(jī)制。 二、材料方法 1．以體外培養(yǎng)的ECV304細(xì)胞和雙層培養(yǎng)系統(tǒng)制成單層血管

4、內(nèi)皮細(xì)胞模型。 2．實(shí)驗(yàn)分組：將細(xì)胞分為正常血清組(A組)、正常血清+SB203580組(B組)、燒傷血清組(C組)、燒傷血清+SB203580組(D組)、正常血清+重組腺病毒組(E組)、燒傷血清+重組腺病毒組(F組)組、空病毒組(G組)和重組腺病毒組(H組)。 3．構(gòu)建Caldesmon重組腺病毒載體，包裝293細(xì)胞，制備重組腺病毒。 4．采用綠色熒光標(biāo)記的白蛋白，觀察A組、B組、C組、D組、E組和F組單層內(nèi)皮

5、細(xì)胞0.5h、1h、2h、4h時(shí)的通透性變化。 5．Western blot法檢測A組、B組、C組、D組p38、p-p38和p-Caldesmon表達(dá)變化以及G組和H組Caldesmon表達(dá)變化，利用免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察A組、B組、C組、D組細(xì)胞F-actin的形態(tài)。 三、主要結(jié)果 1．燒傷血清刺激后，單層內(nèi)皮細(xì)胞的白蛋白濾過明顯增加，SB203580預(yù)處理明顯減少了單層內(nèi)皮細(xì)胞白蛋白濾過。 2．正常內(nèi)皮細(xì)胞p3

6、8激酶磷酸化水平較低，燒傷血清刺激后，p38激酶磷酸化水平明顯增高，SB203580預(yù)處理可以明顯抑制p38激酶磷酸化水平增高，而p38激酶蛋白表達(dá)水平無明顯變化。 3．正常內(nèi)皮細(xì)胞F-actin排列成束狀，與細(xì)胞縱軸大致平行，細(xì)胞中央和周邊無顯著差異。燒傷血清刺激后，細(xì)胞F-actin明顯重排，細(xì)胞收縮變圓，SB203580預(yù)處理可以抑制F-actin的重排。 4．成功構(gòu)建了Caldesmon重組腺病毒載體，重組腺病毒

7、滴度可達(dá)1×10<'9>U/ml，重組腺病毒感染內(nèi)皮細(xì)胞后Caldesmon蛋白的表達(dá)明顯增高。 5．重組腺病毒感染內(nèi)皮細(xì)胞明顯減少了燒傷血清刺激后單層內(nèi)皮細(xì)胞白蛋白濾過。 6．正常內(nèi)皮細(xì)胞磷酸化Caldesmon蛋白水平較低，燒傷血清刺激后，磷酸化Caldesmon蛋白水平明顯增高，SB203580預(yù)處理可以明顯抑制磷酸化Caldesmon蛋白水平增高。 四、討論與結(jié)論 1．燒傷血清可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞通透性

8、增高，p38激酶活性與燒傷血清導(dǎo)致的血管通透性增加密切相關(guān)。 2．細(xì)胞F-actin重排是燒傷血清刺激后單層血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高的重要機(jī)制，而內(nèi)皮細(xì)胞F-actin重排受p38激酶調(diào)控。 3．成功構(gòu)建了Caldesmon重組腺病毒載體，且染效率高，能夠有效表達(dá)目的基因，具有較高的感染力。Caldesmon蛋白在燒傷血清所引起的單層內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高中起重要作用。 4．燒傷血清可明顯增高內(nèi)皮細(xì)胞磷酸化Caldes