散發(fā)性結(jié)直腸癌中hMLH1基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化可變位點(diǎn)圖譜的繪制與分析.pdf

1、目的： 1.建立穩(wěn)定的、可檢測(cè)出目的片段中全部CpG位點(diǎn)甲基化狀態(tài)的重亞硫酸鹽測(cè)序技術(shù)。 2.采用重亞硫酸鹽測(cè)序技術(shù)，繪制散發(fā)性結(jié)直腸癌患者h(yuǎn)MLH1基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化可變位點(diǎn)(MethylationVariablepositions，MVPs)圖譜。 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析MVPs圖譜與患者年齡、性別、腫瘤發(fā)生部位、浸潤(rùn)程度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有無(wú)、臨床病理分期和hMLH1蛋白表達(dá)的相關(guān)性，進(jìn)一步闡明其表觀遺

2、傳學(xué)異常機(jī)制。 方法： 1.重亞硫酸鹽測(cè)序方法的建立 1.1正常人p16基因的甲基化檢測(cè) 選擇多種腫瘤表現(xiàn)為CpG島甲基化的p16基因?yàn)槟Ｐ?。目的序列為p16基因組5端啟動(dòng)子區(qū)19556-20355的800bp片段(GenBankID:AF527803)。由Methprimer軟件分析可知：目的片段含有兩個(gè)CpG島，共有46個(gè)CpG位點(diǎn)；同時(shí)由Methprimer軟件設(shè)計(jì)出與重亞硫酸鹽修飾后序列完全互補(bǔ)且

3、不含任何CpG位點(diǎn)的引物：5’-GTAGGTGGGGAGGAGTTTAGTTT-3’(sense，23bp)；5’-AACTCCTCATTCCTCTTCCTTAACT-3’(anti-sense，25bp)。擴(kuò)增片段位于靶序列的19632至20343位置，大小為712bp。 收集正常人EDTA-K2抗凝外周血，采用EZNARBloodDNAKit提取全血基因組DNA，并用紫外分光光度計(jì)定量。采用EZDNAMethylationK

4、itTM對(duì)全血基因組DNA進(jìn)行重亞硫酸鹽修飾。以修飾后基因組DNA為模板，采用TaKaRaExTaqTMHotStartVersionPolymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到長(zhǎng)度為712bp的目的片段。用核酸外切酶Ⅰ(ExonucleaseⅠ，ExonⅠ)和蝦堿性磷酸酶(ShrimpAlkalinePhosphatase，SAP)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。采用測(cè)序試劑盒-BigDyeV3.1kit進(jìn)行測(cè)序PCR反應(yīng)，然后用ABI3100

5、型測(cè)序儀直接測(cè)序。 1.2腫瘤細(xì)胞株甲基化檢測(cè) 從液氮中取出凍存的腫瘤細(xì)胞株SW480，使之復(fù)蘇，以含10％小牛血清5A-medium培養(yǎng)液，置37℃，5％CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×105。提取腫瘤細(xì)胞基因組DNA，進(jìn)行重亞硫酸鹽修飾后，PCR擴(kuò)增出目的片段，直接測(cè)序(方法同前)。 2.結(jié)直腸癌中hMLH1劇基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島MVPs圖譜的繪制與分析 2.

6、1目的基因的分析及引物設(shè)計(jì) 檢索DNA甲基化數(shù)據(jù)MethDB，同時(shí)，參考文獻(xiàn)和NCBIOMIM數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇與結(jié)直腸癌發(fā)生表觀遺傳學(xué)異常機(jī)制相關(guān)的基因-hMLH1為研究對(duì)象。在NCBI的Gene數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，獲取其參考序列(GenBankID:NM-000249)。將獲取的參考序列遞交DBTSS數(shù)據(jù)庫(kù)，查找轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，確定其啟動(dòng)子區(qū)域，以該區(qū)域作為我們研究的目的片段。將hMLH目的片段遞交至MethPrimer，經(jīng)Methprime

7、r軟件分析可知：目的片段含有兩個(gè)CpG島，CpG島1(CGI-Ⅰ，324bp，1280-1603)和CpG島2(CGI-Ⅱ，167bp，1693-1859)共有46個(gè)CpG位點(diǎn)。 由Methprimer軟件設(shè)計(jì)出靶向兩個(gè)CpG島的重亞硫酸鹽測(cè)序引物：5’-AGGATTTTTTGTTTTGTGATATTTG-3’(sense,25bp)和5’-TTAACCCTACTCTTATAACCTCCC-3'(anti-sense，24bp)

8、，擴(kuò)增片段為493bp(1127-1619)；5'-GGGAGGTTAAGAGTAGGGTTAA-3’(sense,24bp)和5’-AAAATACCTTCAACCAATCACC-3'((anti-sense，22bp)，擴(kuò)增片段為423bp(1596-2018)。 2.2遠(yuǎn)端正常組織甲基化檢測(cè) 提取組織DNA，采用重亞硫酸鹽測(cè)序方法檢測(cè)其甲基化狀況。 2.3腫瘤組織甲基化檢測(cè) 采用克隆測(cè)序來(lái)檢測(cè)其甲基化

9、狀態(tài)。 2.3.1腫瘤細(xì)胞的挑選-手工顯微切割 由于腫瘤組織成分比較復(fù)雜，除了腫瘤細(xì)胞外，還混有非腫瘤細(xì)胞成分，為避免這些細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞甲基化結(jié)果的判定，故應(yīng)將之盡量除去。 將凍存標(biāo)本行OTC包埋，-20℃條件下，切5μm厚冰凍切片一張，蘇木素染色，置顯微鏡下觀察：腫瘤細(xì)胞呈巢狀排列，細(xì)胞核深染、較大且形狀不規(guī)則；正常粘膜上皮排列整齊、細(xì)胞核無(wú)異形性；富含血管和炎性細(xì)胞的間質(zhì)成分呈彌散分布，細(xì)胞核無(wú)異形性；平滑肌

10、細(xì)胞多呈束狀排列，細(xì)胞核為桿狀，形狀規(guī)則。因此，根據(jù)細(xì)胞的排列特點(diǎn)和細(xì)胞核形態(tài)，區(qū)分出腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞，用手術(shù)刀盡量去掉非腫瘤細(xì)胞，再用切片機(jī)切20μm厚冰凍切片3～5張，置入盛有200μlPBS緩沖液的1.5ml離心管中。重復(fù)上述操作3～5次，最后收集20片左右的組織，進(jìn)行后續(xù)DNA提取。 2.3.2克隆測(cè)序 2.3.2.1T-A克隆 首先制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，然后用乙醇法進(jìn)行目的PCR產(chǎn)物的純化，再將純

11、化后的PCR產(chǎn)物與載體pMD18-TVector進(jìn)行連接，再進(jìn)行大腸桿菌的高效轉(zhuǎn)化。 2.3.2.2通用引物驗(yàn)證陽(yáng)性克隆 經(jīng)過(guò)前期測(cè)序試驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)：甲基化修飾片段以反向測(cè)序效果好，正向測(cè)序信號(hào)衰減快。因此，克隆測(cè)序必須保證方向與反向一致，故需選出正向插入的克隆，排除反向插入的克隆。所以，我們采用通用引物來(lái)驗(yàn)證陽(yáng)性克隆：用M13R和目的片段的正向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，就可選出正向插入的克隆，而排除反向插入的克隆。

12、2_3.2.3測(cè)序 每個(gè)樣本均隨機(jī)挑選20個(gè)單菌落，通過(guò)通用引物驗(yàn)證后，選出10個(gè)正向插入的陽(yáng)性克隆，用通用引物-M13R進(jìn)行測(cè)序。 2.3.2.4MVPs圖譜的繪制 采用BIQ_Analyzer軟件分析30例樣本共600個(gè)克隆的CpG位點(diǎn)甲基化分布和頻率，從而繪制hMLH1基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島MVPs圖譜。 3.腫瘤組織hMLH1蛋白表達(dá)的檢測(cè) 4％多聚甲醛固定的標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋，制成5μm的石

13、蠟切片，進(jìn)行HE染色和免疫組化染色。顯微鏡觀察，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和染色強(qiáng)度判定結(jié)果。 4.MVPs圖譜的分析 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析MVPs圖譜與患者年齡、性別、腫瘤發(fā)生部位、浸潤(rùn)程度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有無(wú)、臨床病理分期和hMLH1蛋白表達(dá)的相關(guān)性。 結(jié)論： 1.以p16基因?yàn)槟Ｐ?，建立了穩(wěn)定的重亞硫酸鹽測(cè)序技術(shù)平臺(tái)-可檢測(cè)出目的片段中全部CpG位點(diǎn)的甲基化狀況，為下一步甲基化可變位點(diǎn)(MVPs)圖譜的繪制奠定了良

14、好的基礎(chǔ)。 2.分析30例樣本的hMLH基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化結(jié)果，發(fā)現(xiàn)：CGI-Ⅰ甲基化與hMLH1蛋白表達(dá)缺失有顯著性相關(guān)，而CGI-Ⅱ甲基化與hMLH1蛋白表達(dá)缺失無(wú)顯著性相關(guān)，提示CGI-Ⅰ甲基化可能導(dǎo)致hMLH1蛋白不表達(dá)。而在CGI-Ⅰ的34個(gè)CpG位點(diǎn)中，1至28為甲基化，29至34為非甲基化。故CGI-Ⅰ的1至28CpG位點(diǎn)可能為導(dǎo)致hMLH1蛋白表達(dá)缺失的關(guān)鍵區(qū)域。根據(jù)其甲基化陽(yáng)性率，可將這34個(gè)CpG位點(diǎn)分為4組