一個新的白癜風(fēng)相關(guān)黑素細(xì)胞膜抗原的確認(rèn).pdf

1、背景及目的:白癜風(fēng)是一種常見多發(fā)的色素脫失性皮膚病，其發(fā)病機(jī)制存在多種學(xué)說，目前公認(rèn)與自身免疫有重要關(guān)系。組織學(xué)及免疫細(xì)胞化學(xué)示白癜風(fēng)表皮黑素細(xì)胞消失，活動性白斑邊緣的真皮內(nèi)有淋巴細(xì)胞浸潤；患者血清中存在抗黑素細(xì)胞抗體，且滴度與病變的程度成正比。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，自身抗體與黑素細(xì)胞膜抗原結(jié)合后，通過補(bǔ)體溶解作用、ADCC作用兩條途徑實(shí)現(xiàn)對黑素細(xì)胞的破壞。就目前膜抗原研究的現(xiàn)狀來看，未知抗原較多，雖然已發(fā)現(xiàn)一個新的白癜風(fēng)相關(guān)黑素細(xì)胞膜抗原MC

2、HR1，但白癜風(fēng)患者中抗MCHR1自身抗體的陽性率僅為17.1％，抗MC膜表面抗原的自身抗體陽性率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于抗MCHR1的自身抗體，提示白癜風(fēng)患者血清自身抗體所針對的MC膜表面抗原除了MCHR1外，應(yīng)該另有成分。 本課題組從細(xì)胞直接接觸的膜蛋白入手，尋找具有高識別率的新的細(xì)胞膜抗原，為深入探討其功能及其在白癜風(fēng)發(fā)病中的作用奠定基礎(chǔ)。課題組先期通過雙向電泳與免疫印跡組合策略發(fā)現(xiàn)了一個黑素細(xì)胞膜蛋白，根據(jù)其分子量稱為VIT75。白癜風(fēng)

3、血清識別此蛋白的陽性率達(dá)70％；肽指紋圖(PMF)和肽序列BLAST檢索結(jié)果提示：所發(fā)現(xiàn)抗原為LAMINA/C的可能性最大，但通過原核表達(dá)LAMINA/C，以白癜風(fēng)血清行免疫印跡，識別率不高，即不支持“冠軍肽”為LAMINA/C。 本研究擬在前期工作基礎(chǔ)上，以具有LAMINA/C的人成纖維細(xì)胞和黑素瘤細(xì)胞為研究對象，進(jìn)行雙向電泳及免疫印跡，期望明確成纖維細(xì)胞膜上和黑素瘤細(xì)胞膜上，是否存在與黑素細(xì)胞膜上相同的免疫染色差異蛋白點(diǎn)，以

4、明確LAMINA/C與新抗原的相關(guān)性，為后續(xù)的蛋白功能和病理生理意義研究奠定扎實(shí)的基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)方法: 第一部分細(xì)胞培養(yǎng)和鑒定 1.HEMn培養(yǎng)及純化：首先用含CT和bFGF的10％的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)表皮細(xì)胞4h，然后改用無血清的K-SFM液培養(yǎng)3d，以抑制成纖維細(xì)胞生長，最后傳代細(xì)胞采用含TPA和CT的5％的K-SFM液培養(yǎng)。 2.HEMn鑒定：Dopa染色鑒定及分析黑素細(xì)胞的性質(zhì)及純度。

5、 3.成纖維細(xì)胞純培養(yǎng)：真皮部分1:1比例加入0.05％Ⅰ型膠原酶后4℃消化過夜，過濾，1000rpm離心7分鐘后用無血清DMEM培養(yǎng)液懸浮3次，最后用15％的DMEM/F12調(diào)定細(xì)胞密度以每毫升(2-4)×105個細(xì)胞接種，37℃，5％CO2，90％濕度條件下培養(yǎng)，12小時后換液一次。 4.成纖維細(xì)胞鑒定：胰蛋白酶消化制得細(xì)胞懸液，培養(yǎng)5周的細(xì)胞以1萬/cm2密度接種于蓋玻片上，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，第1抗分別為波形蛋白(V

6、imentin)、結(jié)蛋白(Desmin)和第Ⅷ因子相關(guān)抗原(FactorⅧ)單克隆抗體。 5.人黑色素瘤系Libr細(xì)胞培養(yǎng)：用含10％小牛血清的DMEM/F12按常規(guī)方法培養(yǎng)。 第二部分利用雙向電泳技術(shù)分離、分析黑素瘤細(xì)胞和成纖維細(xì)胞膜抗原 1.高滴度白癜風(fēng)患者血清篩選：消化純的HEMn，以其作為抗原，活細(xì)胞ELISA法對180名白癜風(fēng)患者的血清進(jìn)行篩選。 2.膜蛋白的制備：在以往工作基礎(chǔ)上做了一定的改進(jìn)

7、，引入CHAPS、硫脲、DTT等溶膜蛋白的特點(diǎn)裂解、抽提黑素瘤細(xì)胞及成纖維細(xì)胞膜蛋白。 3.雙向電泳分離及免疫印跡：首先，Bradford法定量上樣總蛋白，制備兩塊平行級2-DE，IPG干膠條(pH4-7)第一向等電聚焦(IEF)，而后行二向分離(SDS-PAGE)，銀染，掃描圖像后行免疫印跡，對比分析白癜風(fēng)和健康人血清的免疫染色差異點(diǎn)。 結(jié)果:黑素瘤細(xì)胞膜上發(fā)現(xiàn)了與VIT75具有相同等電點(diǎn)和分子量的陽性點(diǎn)，提示黑素瘤細(xì)

8、胞膜上存在與正常黑素細(xì)胞膜的共同抗原，VIT75可能是介導(dǎo)殺傷黑素瘤細(xì)胞和破壞正常黑素細(xì)胞的特異性免疫反應(yīng)的重要抗原。而成纖維細(xì)胞的免疫印跡圖中未發(fā)現(xiàn)有陽性著色點(diǎn)，因此否定了膜抗原VIT75是LAMINA/C的可能。因此，VIT75是一個新發(fā)現(xiàn)的白癜風(fēng)抗原。下一步的研究目標(biāo)是進(jìn)一步明確VIT75基因序列，明確蛋白屬性，為蛋白的病理生理意義研究奠定基礎(chǔ)。 結(jié)論:VIT75是黑素瘤和黑素細(xì)胞膜上共有的尚未被認(rèn)識的白癜風(fēng)相關(guān)抗原，而非