兒童哮喘iNOS基因5′調(diào)控區(qū)（CCTTT）n缺失的初步研究.pdf

1、研究背景和目的；支氣管哮喘是由嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞參與的慢性炎癥，以氣道壁重建和非特異性氣道高反應(yīng)性為特征。雖然環(huán)境因素在哮喘的發(fā)生、發(fā)展中有重要作用，但是大量受累同胞和家系研究己證實(shí)哮喘具家族聚集性，表明哮喘有明顯的遺傳傾向。通過基因組掃描、候選基因技術(shù)，確認(rèn)哮喘是一種復(fù)雜的多基因遺傳病，但哪些基因參與了哮喘的發(fā)生、發(fā)展尚未明確。 一氧化氮(nitricoxide,NO)作為一種可在細(xì)胞間自由擴(kuò)散的

2、信使分子，是一種反應(yīng)性極強(qiáng)的自由基，具有非常強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性作用，在神經(jīng)遞質(zhì)傳遞和血管舒張調(diào)節(jié)等生理與病理過程中起重要作用。NO以分子氧和L-精氨酸為底物，由一氧化氮合酶(NOsynthase,NOS)催化合成。在炎癥細(xì)胞因子等誘導(dǎo)下，iNOS編碼基因被激活，大量而持續(xù)合成NO，介導(dǎo)炎癥、休克、哮喘等疾病的發(fā)生。目前在哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)細(xì)胞來源、表達(dá)方式和活性調(diào)節(jié)不同的3種NOS同工酶，分別為神經(jīng)元型NOS(neuronalNOS,nNOS

3、)、誘導(dǎo)型NOS(inducibleNOS,iNOS)和內(nèi)皮細(xì)胞型NOS(endothelialNOS,eNOS)。3種NOS由位于不同染色體上的基因所編碼。人iNOS基因位于第17號(hào)染色體長臂(17q11.2-17q12)，全長約37kb，含有26個(gè)外顯子。iNOS可在多種類型的細(xì)胞中通過IL-1、IFN-α、TNF-γ等細(xì)胞因子和其他介質(zhì)的刺激作用而誘導(dǎo)表達(dá)。iNOS基因5’-端調(diào)控區(qū)內(nèi)存在一個(gè)CCTTT串聯(lián)重復(fù)的多態(tài)性位點(diǎn)，這一多

4、態(tài)性基因座已在北愛爾蘭的糖尿病患者中證實(shí)與微血管病變有關(guān)。有實(shí)驗(yàn)表明CCTTT串聯(lián)重復(fù)序列的變化對(duì)iNOS基因的轉(zhuǎn)錄將產(chǎn)生不同影響，但中國人群中有關(guān)iNOS基因CCTTT串聯(lián)重復(fù)序列與哮喘的相關(guān)性目前尚未見報(bào)道。 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用PCR-STR方法，對(duì)iNOS基因5’調(diào)控區(qū)短串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)和分析，旨在了解iNOS基因表達(dá)、調(diào)控與兒童哮喘的關(guān)聯(lián)情況，為兒童哮喘疾病基因篩選和定位提供資料。 材料與方法；本實(shí)驗(yàn)分為哮喘組

5、與健康對(duì)照組，來自鄭州市兒童醫(yī)院，哮喘組77例為本院哮喘門診就診和呼吸科住院病人，其中男43例，女34例，年齡2歲～12歲，按照全國兒科哮喘協(xié)作組1998年修訂的哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)確診為哮喘，并按標(biāo)準(zhǔn)劃分為輕度、中度和重度三組；健康對(duì)照組102例為本院門診和保健科健康體檢兒童，男49例，女53例，年齡在2歲～10歲，均無哮喘史、哮喘家族史和典型過敏史。 抽取受檢者外周靜脈血，EDTA抗凝，采用經(jīng)典的SDS-蛋白酶K-酚-氯仿等方法提取

6、基因組DNA。PCR擴(kuò)增iNOS基因5’調(diào)控區(qū)短串聯(lián)重復(fù)序列，6％聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠經(jīng)過固定、染色、顯色三步處理至帶型清晰，判讀擴(kuò)增條帶。 PCR檢測(cè)iNOS基因5’調(diào)控區(qū)短串聯(lián)重復(fù)序列基因片段可見176bp的條帶，重復(fù)三次擴(kuò)增未顯帶但其他STR位點(diǎn)擴(kuò)增顯帶者視為缺失型，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算哮喘組和正常對(duì)照組的基因型，病例組和對(duì)照組間iNOS基因5’調(diào)控區(qū)短串聯(lián)重復(fù)序列缺失的差異用X2檢驗(yàn)。以α=0.05作為顯著性

7、水準(zhǔn)，所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析都在SPSS11.0軟件包中完成。 結(jié)果；(1)iNOS基因5’調(diào)控區(qū)短串聯(lián)重復(fù)序列PCR檢測(cè)結(jié)果：77例哮喘患兒中63例5’調(diào)控區(qū)短串聯(lián)重復(fù)序列缺失，缺失率81.82％；對(duì)照組102例，25例缺失，缺失率24.51％，對(duì)照組與病例組基因缺失率經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)差異有顯著性(x2=57.66，P＜0.05)。 (2)哮喘患兒病情與iNOS基因5’調(diào)控區(qū)短串聯(lián)重復(fù)序列缺失的關(guān)系：77例哮喘患兒中，輕度患者19

8、例，缺失型11例，缺失率57.89％；中型43例，缺失型38例，缺失率88.37％；重度15例，缺失型14例，缺失率93.33％。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析組間差異，輕度、中度患兒之間差異無顯著性(X21=0.295，P＞0.05)，中度與重度之間、輕度與重度之間比較，均有顯著性差異(x22=7.386，P＜0.05；X23=7.383，P＜0.05)。輕度與中度+重度組比較差異有顯著性(x24=9.705，P＜0.05)。 (3)哮喘患兒年齡