MKK4和MKK7在胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化以及MKK7在心肌發(fā)育毒理過程中的調(diào)控作用.pdf

1、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在不同細(xì)胞體系的發(fā)育中具有重要但又互不相同的調(diào)控作用。MKK4和MKK7是MAPK的上游激酶通路，是介導(dǎo)生理或者病理?xiàng)l件下細(xì)胞生物學(xué)應(yīng)答的重要信號系統(tǒng)。這兩個(gè)激酶對于胎鼠的發(fā)育存活具有重要作用，但由于其基因敲除的胚胎致死性，他們在發(fā)育過程中的精確調(diào)控機(jī)制還不清楚。胚胎干細(xì)胞的體外分化模型為研究胚胎致死性基因在體內(nèi)發(fā)育過程中細(xì)胞特異性和階段特異性的作用提供了有效的載體。通過使用胚胎干細(xì)胞體外分化的模型結(jié)合MKK4和MKK7基因

2、敲除的鼠科類胚胎干細(xì)胞，我們探討了MKK4和MKK7在體外分化過程中的重要作用。MKK4和MKK7在干細(xì)胞的自我增殖更新和維持干細(xì)胞的特性中無特異性作用，但是在不同細(xì)胞體系的分化中具有不同的調(diào)控作用。首先，我們成功建立了胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞分化的模型。在心肌細(xì)胞分化的研究中，我們發(fā)現(xiàn)通過擬胚體(EBs)的形成，干細(xì)胞可以分化為內(nèi)，中，外三個(gè)胚層的細(xì)胞，其中大部分分化為中胚層細(xì)胞，在分化的中胚層細(xì)胞中又有大部分細(xì)胞屬于心肌細(xì)胞。

3、在心肌細(xì)胞分化研究中我們發(fā)現(xiàn)，一方面，MKK4和MKK7通過MAPKK-MAPK模式共同激活JNK-cJUN信號通路，MKK4和MKK7的雙重敲除導(dǎo)致JNK-cJUN信號通路的失活從而引起分化細(xì)胞的老化。另一方面，在分化過程中，MKK4和MKK7對于p38通路的磷酸化活化具有相反的調(diào)控作用。MKK7減少p38的磷酸化活化，具體表現(xiàn)在MKK7基因敲除的干細(xì)胞分化過程中，磷酸化的MKK4，p38和ATF2表達(dá)量增加，同時(shí)Mef2c的基因表達(dá)

4、增加。從而引起MKK7基因敲除分化的干細(xì)胞中Mhc和Mlc的基因表達(dá)量同時(shí)收縮性心肌細(xì)胞的形成增加。與此相反，MKK4在干細(xì)胞分化過程中增加p38的磷酸化活化，所以MKK4基因敲除的分化的干細(xì)胞中磷酸化的ATF2和Mef2c的基因表達(dá)量減少，同時(shí)引起Mhc表達(dá)量的減少和心肌細(xì)胞發(fā)育的缺陷。外源性表達(dá)的MKK4部分上修復(fù)了MKK4基因敲除細(xì)胞心肌細(xì)胞發(fā)育的缺陷，從而進(jìn)一步證實(shí)了MKK4在心肌細(xì)胞發(fā)育中的重要作用。我們的研究提示了MKK4和

5、MKK7在早期發(fā)育過程中相互依存又互不相同的作用，同時(shí)證實(shí)了MKK4在p38的激活和心肌發(fā)育中的重要調(diào)控作用。此外，環(huán)境中很多因子可以通過影響MKK4和MKK7信號通路導(dǎo)致發(fā)育毒性。我們發(fā)現(xiàn)非細(xì)胞毒性的雙酚A(Bisphenol-A)和鎳(Nickel)都有很強(qiáng)的心臟發(fā)育的毒性，MKK7基因敲除的細(xì)胞可以代償雙酚A引起的心肌發(fā)育毒性，表明MKK7在雙酚A引起的心肌發(fā)育毒性中有重要作用。
　　 一、MKK4和MKK7在心肌細(xì)胞分化

6、過程中不同的調(diào)控作用
　　 （一）目的探討MKK4和MKK7及其下游MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化過程中的作用。
　　 （二）方法通過westernblotting和免疫熒光染色檢測心肌細(xì)胞分化過程中MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白的表達(dá)水平。在干細(xì)胞分化的不同時(shí)期，通過real-timePCR檢測心肌特異性基因的表達(dá)水平。在心肌細(xì)胞分化過程中，檢測p38絲裂原活化激酶的磷酸化水平，并使用其特異性抑制劑SB202

7、190探討p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在心肌細(xì)胞分化過程中的作用。在MKK4基因敲除的干細(xì)胞中通過建立穩(wěn)定細(xì)胞系修復(fù)MKK4的表達(dá)。通過GST-pulldown和體外激酶活性測定探討MKK4-p38的相互作用。通過染色體免疫共沉淀檢測不同轉(zhuǎn)錄因子對MHC基因表達(dá)不同的調(diào)控作用。
　　 （三）結(jié)果我們建立了胚胎干細(xì)胞向內(nèi)胚層、中胚層、外胚層細(xì)胞分化的體外分化模型。結(jié)合胚胎干細(xì)胞體外分化模型及不同的MAP2Ks基因敲除細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)了

8、MKK4-p38-ATF2和MKK4/7-JNK-c-JUN信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在干細(xì)胞分化過程中不同的調(diào)控作用。首先，我們發(fā)現(xiàn)MKK4/7-JNK-c-JUN信號通路在分化細(xì)胞存活中的重要作用;其次，我們發(fā)現(xiàn)MKK4-p38信號通路激活過程中新的分子機(jī)制研究及MKK4-p38信號通路在MHC基因表達(dá)及心肌細(xì)胞分化過程中的調(diào)控作用;同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)MKK7通過與MKK4-p38相互作用降低體外分化過程中的心肌形成。這一研究揭示了分化發(fā)育過程中一

9、個(gè)新的分子信號機(jī)制。
　　 （四）結(jié)論基于這些數(shù)據(jù)，我們提出MKK4和MKK7在干細(xì)胞分化過程中具有互相補(bǔ)充又互不相同的作用。MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在發(fā)育過程中的分子信號機(jī)制可以通過干細(xì)胞體外分化模型檢測和評估。
　　 二、MKK7在環(huán)境因子導(dǎo)致的心肌發(fā)育毒性中的作用
　　 （一）目的評估MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在環(huán)境因子導(dǎo)致的心肌發(fā)育毒性中的作用。
　　 （二）方法在干細(xì)胞體外分化過程中，我們用非細(xì)胞毒性的

10、不同的環(huán)境因子處理細(xì)胞。然后顯微鏡下觀察跳動(dòng)性心肌的形成同時(shí)通過real-timePCR檢測不同的基因表達(dá)評估其心肌發(fā)育毒性。為了探討雙酚A和雌激素是否通過雌激素受體介導(dǎo)心肌發(fā)育毒性，我們在雙酚A和雌激素處理過程中同時(shí)使用雌激素受體的特異性抑制劑ICI182，780來處理細(xì)胞。
　　 （三）結(jié)果用不同的環(huán)境因子處理分化過程中的干細(xì)胞，鎳在野生型和Mkk7(-/-)細(xì)胞中都可以100％抑制跳動(dòng)性心肌細(xì)胞形成，表明其強(qiáng)的心肌毒性。有

11、趣的是，雙酚A和雌激素在野生型細(xì)胞中可以完全抑制跳動(dòng)性心肌細(xì)胞的形成，但是Mkk7(-/-)細(xì)胞可以完全代償雙酚A和雌激素引起的心肌毒性。這一觀察表明雙酚A和雌激素主要通過MKK7介導(dǎo)心肌毒性。雌激素受體特異性抑制劑不能緩解這一表現(xiàn)型，表明雙酚A和雌激素通過非雌激素受體依賴性的方式介導(dǎo)心肌發(fā)育毒性。
　　 （四）結(jié)論基于這些數(shù)據(jù)，我們指出環(huán)境因子刺激可以激活MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)而調(diào)控心肌發(fā)育。MKK7可能介導(dǎo)雙酚A引起的心肌毒