FBP、TBC1D20、TBXA2R、MKK7在HCV患者中及干擾素作用肝細(xì)胞后的表達(dá)研究.pdf

1、背景與目的： 丙肝是一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病，全球約1.7億人口感染丙型肝炎病毒[1]，干擾素聯(lián)合利巴韋林是目前最有效的治療方法，但其持續(xù)性應(yīng)答療效并不很理想，療程長(zhǎng)，且藥物的不良反應(yīng)比較明顯，費(fèi)用較高，其中HCV基因2型、3型患者的SVR率接近80％，而HCV基因1型患者的SVR率只有50％[2]，我國(guó)主要以基因1b型為主[3]，研究開發(fā)高效抗HCV藥物是目前的當(dāng)務(wù)之急。 HCV不同的基因分型及高變異率導(dǎo)致易出現(xiàn)耐

2、藥問(wèn)題，使得以HCV為靶點(diǎn)的抗病毒治療研究進(jìn)入瓶頸，隨著對(duì)HCV感染復(fù)制過(guò)程認(rèn)識(shí)的不斷深入，揭示宿主基因在HCV的入侵、復(fù)制、包裝、釋放等過(guò)程中起了不可或缺的角色[4-6]，且宿主基因較穩(wěn)定不存在高變異率，以宿主基因?yàn)樗幬锇袠?biāo)可克服因病毒變異導(dǎo)致的耐藥問(wèn)題，但目前研究的相關(guān)基因?qū)λ拗鞅旧韥?lái)說(shuō)作為治療靶標(biāo)會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的毒副作用，理想的抗病毒藥物應(yīng)為在不損傷宿主細(xì)胞的前提下特異性抑制清除病毒。進(jìn)一步深入研究病毒與宿主的相互作用可為研發(fā)新的抗病

3、毒藥物提供思路。 隨著HCV體外模型的不斷改進(jìn)及分子生物技術(shù)的進(jìn)步，近幾年陸續(xù)在體外發(fā)現(xiàn)了一些新的宿主基因在HCV復(fù)制中起到不可或缺的作用，其中c—myc原癌基因遠(yuǎn)端結(jié)合蛋白(FBP)、Rab—GTP酶激活蛋白(TBC1D20)、血栓素A2受體(TBXA2R)、蛋白激酶(MKK7)在HCV復(fù)制中發(fā)揮重要作用[7-9]，但其本身及其與HCV的相關(guān)研究報(bào)道較少，闡明HCV與上述宿主基因之間相互作用的分子機(jī)制，不僅加深對(duì)HCV生物學(xué)的

4、了解同時(shí)更為病毒的防治提供一些新思路。病毒感染性疾病是病毒與宿主細(xì)胞相互作用的結(jié)果，一方面病毒通過(guò)宿主內(nèi)環(huán)境完成感染復(fù)制，另一方面宿主啟動(dòng)一系列抗病毒通路抑制清除感染入侵的病原體。因此人為抑制HCV復(fù)制的宿主基因的表達(dá)或是上調(diào)體內(nèi)不同的抗病毒通路的表達(dá)都可為發(fā)現(xiàn)新的抗HCV提供前景。HCV感染宿主后將引起宿主基因表達(dá)發(fā)生改變，抗病毒治療應(yīng)根據(jù)宿主細(xì)胞病變基因表達(dá)水平的異常狀況，采取不同的策略，以提高或補(bǔ)足表達(dá)水平低下的基因，或降低表達(dá)水

5、平過(guò)高的基因，或?qū)υ谡顩r下不表達(dá)的基因進(jìn)行封閉或破壞?；诖耍覀冄芯縃CV感染復(fù)制對(duì)幾種宿主HCV復(fù)制相關(guān)基因(FBP、TBC1D20、TBXA2R、MKK7)表達(dá)的影響，可為制定針對(duì)宿主的抗病毒治療策略提供理論依據(jù)。 干擾素聯(lián)合利巴韋林是目前最有效的抗HCV方法，但具體機(jī)制未明，國(guó)內(nèi)外有文獻(xiàn)報(bào)道干擾素可調(diào)節(jié)多種宿主基因的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)抗增生、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能，干擾素是機(jī)體防御系統(tǒng)的重要研究對(duì)象，因此研究干

6、擾素及利巴韋林對(duì)FBP、TBC1D20、TBXA2R、MKK7等基因表達(dá)的調(diào)控，可以深入闡明干擾素抗病毒機(jī)制同時(shí)有利于發(fā)現(xiàn)體內(nèi)新的抗病毒靶點(diǎn)。 本課題研究旨在初步探討HCV RNA在患者PBMC中的存在情況，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步檢測(cè)幾種HCV復(fù)制相關(guān)宿主基因在患者PBMC中的表達(dá)水平，同時(shí)在體外觀察干擾素及利巴韋林對(duì)FBP、TBC1D20、TBXA2R、MKK7表達(dá)的影響，為制定針對(duì)宿主基因的抗病毒治療策略提供理論依據(jù)。

7、方法： 1、定量檢測(cè)40例HCV患者PBMC中HCV RNA的表達(dá)情況 收集40例未用過(guò)抗病毒治療的HCV患者，分離患者PBMC，提取總RNA，合成cDNA第一鏈，進(jìn)行SYBR Green Realtime PCR擴(kuò)增反應(yīng)，統(tǒng)計(jì)計(jì)算患者PBMC中HCV RNA的載量及與血清中HCV RNA載量的相關(guān)性。 2、定量檢測(cè)30例HCV患者及15例健康對(duì)照PBMC中FBP、TBC1D20、TBXA2R、MKK7宿主基因的

8、表達(dá)情況 從上述40例HCV患者中選取30例未用過(guò)抗病毒治療的患者，按CHC及LC分為兩組，每組各15例，另設(shè)健康對(duì)照組15例，分離PBMC，提取總RNA，合成cDNA第一鏈，進(jìn)行SYBR Green Realtime PCR擴(kuò)增反應(yīng)，統(tǒng)計(jì)計(jì)算每例標(biāo)本PBMC中FBP、TBC1D20、TBXA2R、MKK7的表達(dá)情況，結(jié)合臨床資料分析三組中上述基因表達(dá)是否存在差異及與臨床資料的相關(guān)性。 3、定量檢測(cè)20例HCV患者PBM

9、C中IRF—3、IRF—7、IFN—γ、JAK-1及USP18的表達(dá)情況 從上述CHC及LC兩組中分別隨機(jī)抽取10例患者，用上述方法定量檢測(cè)PBMC中IRF—3、IRF—7、IFN—γ、JAK-1及USP18mRNA水平。 4、檢測(cè)干擾素—2α及利巴韋林作用HEPG2細(xì)胞株前后FBP、TBC1D20、TBXA2R、MKK7的表達(dá)情況 體外培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞株HepG2，將處理藥物分成三組：干擾素—2α、利巴韋林及干擾

10、素—2α聯(lián)合利巴韋林，分別以不同濃度和不同時(shí)間作用于HepG2細(xì)胞，提取總RNA，合成cDNA第一鏈，進(jìn)行SYBR Green Realtime PCR擴(kuò)增反應(yīng)，統(tǒng)計(jì)計(jì)算給予不同處理的HepG2細(xì)胞株中FBP、TBC1D20、TBXA2R、MKK7基因的表達(dá)情況。 結(jié)果： 1、40例抗HCV陽(yáng)性的患者中35例血清HCV RNA陽(yáng)性，5例血清HCV RNA陰性，35例血清HCVRNA陽(yáng)性的患者中30例PBMCs中可測(cè)定到H

11、CVRNA，而5例血清HCV RNA陰性的患者中2例PBMCs中檢測(cè)到HCVRNA。統(tǒng)計(jì)結(jié)果示患者外周血清中HCV RNA載量與PBMCs中HCV RNA載量無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。 2、FBP、TBC1D20 mRNA在CHC及LC組PBMCs中表達(dá)較健康對(duì)照組增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但在CHC和LC兩組比較未見顯著差異(P>0.05)。在CHC、LC及健康對(duì)照三組中未觀察到PBMC中MKK7、TBXA2R mR

12、NA表達(dá)水平存在顯著差異(P>0.05)。統(tǒng)計(jì)分析HCV患者外周血PBMCs中FBP、TBC1D20 mRNA的表達(dá)水平與患者肝功能、HCVRNA載量及IRF—3、IRF—7、IFN—γ、JAK、USP18等表達(dá)水平均未見相關(guān)性(P>0.05)。 3、干擾素—2α作用HePG2細(xì)胞引起TBC1D20 mRNA表達(dá)下調(diào)，且觀察到劑量依賴型(P<0.05)，即隨著干擾素劑量的加大TBC1D20 mRNA表達(dá)顯著下調(diào)。未觀察到干擾素—

13、2α影響FBP、TBXA2R、MKK7mRNA的表達(dá)水平(P>0.05)。本研究結(jié)果沒(méi)有顯示利巴韋林影響TBC1D20、FBP、TBXA2R、MKK7等的表達(dá)水平，亦未觀察到利巴韋林與干擾素在下調(diào)TBC1D20 mRNA表達(dá)上有協(xié)同作用(P>0.05)。 結(jié)論： 1、HCV患者PBMCs中可測(cè)定到HCV RNA，血清中HCV RNA載量與PBMCs中HCV RNA載量無(wú)相關(guān)性。 2、FBP、TBC1D20mRNA