huh7.5.1細胞感染hcv并干擾素治療過程中mirna表達譜的變化的研究

1、浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文Huh7.5.1細胞感染HCV并干擾素治療過程中miRNA表達譜的變化的研究姓名：魯袞申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：藥理學(xué)指導(dǎo)教師：陳智2012-11-30浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 中文摘要錄水平上的基因沉默( t r a n —s c r i p t i o n a lg e n es i l e n c i n g ，T G S ) ，另一種是轉(zhuǎn)錄后基因沉默( p o s t - t r a n s c r i p t i

2、 o n a l g e n e s i l e n - c i n g ，P T G S ) ，即在基因轉(zhuǎn)錄后的水平上通過對目標(biāo)R N A 進行特異性降解而導(dǎo)致基因失活。這是為了保護自身，動植物在長期進化過程中形成的一種限制外源核酸入侵的防衛(wèi)保護機制。M i c r o R N A ( M i R N A ) 是細胞內(nèi)一類表達豐富、非編碼的高度保守的小R N A ，長度為1 8 ．2 5n t 。M i R N A 表現(xiàn)出一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)

3、控基因表達的全新機制，它通過結(jié)合靶基因的m R N A 的3 ’U T R 抑制基因的表達。M i R N A 已經(jīng)被證實在發(fā)育、感染、免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)和腫瘤的發(fā)生等多種生理與病理過程中發(fā)揮作用。從最初發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在，已經(jīng)在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)了7 0 0 多個M i R N A ，其中絕大部分M i R N A 的生物學(xué)功能是未知的。已有報道，M i R N A 參與免疫應(yīng)答中多方面的調(diào)控作用。但目前為止，尚未見報道M i R N A 能夠調(diào)

4、控干擾素的信號通路進而影響抗病毒天然免疫，也沒有報道M i R N A 參與到干擾素對免疫細胞功能的調(diào)控作用。正是基于上述研究背景，我們?yōu)榱颂綄た赡軐Ρ透窝撞《? H C V ) 轉(zhuǎn)染，復(fù)制及清除有作用的M i R N A ，我們首先通過對p F L ．J 6 J F H ．1 質(zhì)粒進行體外轉(zhuǎn)錄得到H C VR N A 的轉(zhuǎn)錄體，然后在H u h 7 ．5 ．1 細胞培養(yǎng)達到6 0 ％～7 0 ％匯合度時，把H C V R N A 轉(zhuǎn)

5、染進去。轉(zhuǎn)染后第3 天，提取感染細胞內(nèi)的總R N A ，并通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對其進行擴增，與正常H u h 7 ．5 ．1 細胞作對比，以確定轉(zhuǎn)染是否成功。然后用I F N O L ．2 B 處理上述感染細胞，4 8 h 后再次使用熒光定量P C R 對細胞內(nèi)R N A 進行檢測，并與未經(jīng)任何處理的感染細胞作對比。最后采用M i R N A 表達譜芯片技術(shù)對正常H u h 7 ．5 ．1 細胞，H C V 感染后的H u h 7 ．5 ．

6、1 細胞，以及感染后經(jīng)干擾素治療的H u h 7 ．5 ．1 細胞分別進行了M i R N A 的表達的測定，并采用2 ( ．A A C T ) 法分析組間M i R N A 的表達情況。結(jié)果經(jīng)過篩選我們發(fā)現(xiàn)與正常H u h 7 ．5 ．1 細胞中表達的M i R N A 相比，有1 3 種M i R N A 在H C V 感染后表達上調(diào)，而在干擾素治療后則出現(xiàn)下調(diào)；另外還有7 種M i R N A 則在H C V 感染后出現(xiàn)表達下調(diào)，