用GSK-3β特異的RNAi腺病毒載體研究Wnt-β-catenin信號(hào)途徑對(duì)人甲狀腺細(xì)胞增殖凋亡的影響.pdf

1、目的： 以糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)特異的RNA干擾(RNAi)腺病毒表達(dá)載體作為研究工具，從轉(zhuǎn)錄后水平抑制GSK-3β基因表達(dá)，初步探討Wnt/β-連環(huán)蛋白(Wnt/β-catenin)，信號(hào)途徑對(duì)人甲狀腺細(xì)胞增殖凋亡的影響。 方法： 設(shè)計(jì)合成針對(duì)GSK-3βmRNA序列的短發(fā)夾RNA(shRNA)編碼序列，克隆到腺病毒穿梭質(zhì)粒中，然后通過體外同源重組構(gòu)建重組RNAi腺病毒表達(dá)載體，在HEK293A細(xì)

2、胞中包裝并擴(kuò)增病毒、空斑實(shí)驗(yàn)法測(cè)定病毒滴度；腺病毒感染原代培養(yǎng)人甲狀腺細(xì)胞，Western blot法檢測(cè)其對(duì)GSK-3β表達(dá)的抑制效應(yīng)，并探討不同感染復(fù)數(shù)(MOI)及病毒感染時(shí)間對(duì)GSK-3β的抑制效應(yīng)；利用RNAi腺病毒抑制GSK-3β表達(dá)，溴脫氧尿苷(BrDU)法檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，探討Wnt/β-catenin信號(hào)途徑對(duì)人甲狀腺細(xì)胞增殖和凋亡的影響。 結(jié)果： 1.成功構(gòu)建了GSK-3β特異的RN

3、Ai腺病毒表達(dá)載體，在HEK293A細(xì)胞中包裝、擴(kuò)增腺病毒，獲得高滴度腺病毒上清，測(cè)定擴(kuò)增第二代的病毒液滴度在1.6×1010pfu～5.0×1010pfu之間，可滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要。 2.RNAi腺病毒感染人甲狀腺細(xì)胞后可使GSK-3β表達(dá)量明顯下降，RNAi腺病毒MOI值為100時(shí)可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞GSK-3β表達(dá)的有效抑制；RNAi腺病毒感染后48h開始檢測(cè)到GSK-3β表達(dá)量下降，且隨時(shí)間延長(zhǎng)GSK-3β表達(dá)量進(jìn)一步減少，抑制效

4、應(yīng)可持續(xù)至少6天；RNAi腺病毒感染人甲狀腺細(xì)胞后β-catenin表達(dá)量顯著增加。 3.腺病毒感染人甲狀腺細(xì)胞1day、3day、5day、7day后，RNAi腺病毒組與空病毒組相比，細(xì)胞增殖率明顯增加(P<0.05)；但流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果提示RNAi腺病毒感染對(duì)細(xì)胞凋亡的影響不明顯。 結(jié)論： 構(gòu)建的GSK-3β特異的RNAi腺病毒表達(dá)載體能有效抑制GSK-3β基因表達(dá)，可以作為研究wnt/β-catenin信號(hào)