七氟醚預(yù)處理聯(lián)合后處理對大鼠急性心肌缺血再灌注損傷的影響及相關(guān)機制的研究.pdf

1、第一部分七氟醚預(yù)處理聯(lián)合后處理對大鼠急性心肌缺血再灌注損傷的影響
　　 目的：探討七氟醚預(yù)處理聯(lián)合后處理對大鼠急性心肌缺血再灌注損傷的影響。
　　 方法：健康雄性Wistar大鼠50只，體重250～280g，采用隨機數(shù)字表法，將大鼠隨機分為5組(n=10）：假手術(shù)組（S組）、缺血再灌注組(I/R組)、七氟醚預(yù)處理組（Spre組）、七氟醚后處理組（Spo組）和七氟醚預(yù)處理聯(lián)合后處理組（Spre+po組）。S組大鼠冠狀動脈只

2、穿線不結(jié)扎；I/R組采用結(jié)扎左冠狀動脈前降支30min，再灌注2h的方法制備大鼠心肌缺血再灌注模型，術(shù)中吸入2L/min純氧，缺血前后及再灌注前后不再給予其他干預(yù)；Spre組缺血前30min吸入2.5％七氟醚15min，洗脫15min，結(jié)扎左冠狀動脈前降支30min，再灌注2h；Spo組大鼠再灌注前1min吸入2.5％七氟醚5min，再灌注2h。Spre+po組大鼠于缺血前30min吸入2.5％七氟醚15min，洗脫15min，結(jié)扎左冠

3、狀動脈前降支30min，再灌注前1min吸入2.5％七氟醚5min，再灌注2h。
　　 分別于左冠狀動脈前降支穿線并穩(wěn)定10min(T0)、缺血30min(T1)、再灌注5min(T2)、10min(T3)、1h(T4)、2h(T5)時記錄平均動脈壓(MAP)和心率(HR)。分別于左冠狀動脈前降支穿線并穩(wěn)定10min(preischemia)、再灌注2h末測定左室收縮壓(LVSP)、左室舒張末壓(LVDEP)、左室內(nèi)壓上升/下降

4、的最大速率(±dp/dtmax)，計算左室發(fā)展壓(LVDP=LVSP-LVDEP)。于再灌注2h時經(jīng)左頸動脈取血，采用比色法檢測血清血清乳酸脫氫酶(LDH)和磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)的活性，雙向側(cè)流免疫法測定心肌肌鈣蛋白I(cTnI)濃度。每組隨機取5只大鼠測定心肌缺血區(qū)體積和梗死區(qū)體積。每組取剩余5只大鼠處死取心臟，透射電鏡下觀察心肌超微結(jié)構(gòu)并行線粒體損傷評分。
　　 結(jié)果：
　　 1．各組大鼠HR的比較各組大

5、鼠T0時HR比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；與S組比較，其余各組T1～T5時HR降低（P＜0.05），MAP降低(P＜0.05)；與I/R組比較，Spre組、Spo組與Spo+pre組T3、T5時HR降低(P＜0.05)，T3～T5時MAP升高(P＜0.05)；Spre組、Spo組和Spo+pre組HR比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 2．各組大鼠LVDP、±dp/dtmax的比較各組preischemia L

6、VDP、±dp/dtmax比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與S組比較，I/R組LVDP、±dp/dtmax降低；與I/R組比較，Spre組、Spo組LVDP、±dp/dtmax升高；與Spre組、Spo組比較，Spo+pre組LVDP、±dp/dtmax升高。除S組外，各組組內(nèi)與preischemia比較，LVDP、±dp/dtmax降低。
　　 3．各組間血清LDH和CK-MB的活性及cTnI濃度的比較與S組比較，I/R組血清LDH和C

7、K-MB的活性及cTnI濃度升高(P＜0.05或0.01)；與I/R組比較，Spre組和Spo組血清LDH和CK-MB的活性及cTnI濃度降低(P＜0.05或0.01)；與Spre組和Spo組比較，Spre+po組血清LDH和CK-MB的活性及cTnI濃度降低（P＜0.05）。
　　 4．各組大鼠心肌梗死區(qū)體積的比較各組缺血區(qū)體積差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，與I/R組比較，Spre組、Spo組與Spre+po組心肌梗死區(qū)體

8、積減小(P＜0.05或0.01)，與Spre組和Spo組比較，Spre+po組心肌梗死區(qū)體積減小(P＜0.05)。
　　 5．心肌超微結(jié)構(gòu)的變化 S組肌原纖維間排列整齊，線粒體膜完整，線粒體嵴部分清晰，結(jié)構(gòu)完整；I/R組肌原纖維排列紊亂，線粒體腫脹明顯，線粒體膜不完整，線粒體嵴消失；Spre組肌原纖維間水腫，線粒體膜完整，線粒體嵴部分消失；Spo組肌原纖維間水腫，線粒體膜完整，線粒體中度水腫，線粒體嵴部分消失；Spre+po組肌

9、原纖維間水腫，線粒體局部輕度水腫，線粒體膜完整，線粒體嵴部分消失。
　　 與S組比較，I/R組線粒體損傷評分升高，比表面和面數(shù)密度降低（P＜0.01）；與I/R組比較，Spre組和Spo組線粒體損傷評分降低，比表面和面數(shù)密度升高(P＜0.05或0.01)；與Spre組和Spo組比較，Spre+po組線粒體損傷評分降低，比表面和面數(shù)密度升高（P＜0.05）。
　　 結(jié)論：七氟醚預(yù)處理聯(lián)合后處理較單獨處理減輕心肌缺血再灌注損

10、傷的作用增強。
　　 第二部分七氟醚預(yù)處理聯(lián)合后處理減輕大鼠急性心肌缺血再灌注損傷的相關(guān)機制
　　 目的：探討七氟醚預(yù)處理聯(lián)合后處理減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷的機制。
　　 方法：健康雄性Wistar大鼠50只，體重250～280g，采用隨機數(shù)字表法，將大鼠隨機分為5組（n=10）。假手術(shù)組（S組）大鼠冠脈只穿線不結(jié)扎；缺血再灌注組(I/R組)結(jié)扎左冠狀動脈前降支30min，再灌注2h制備大鼠心肌缺血再灌注模型，

11、術(shù)中吸入2L/min純氧，缺血前后及再灌注前后不再給予其他干預(yù)；七氟醚預(yù)處理組（Spre組）缺血前30min，吸入2.5％七氟醚15min，洗脫15min，余處理同I/R組；七氟醚后處理組（Spo組）大鼠再灌注前1min吸入2.5％七氟醚5min，再灌注2h，余處理同I/R組。七氟醚預(yù)處理聯(lián)合后處理組（Spre+po組）缺血前30min，吸入2.5％七氟醚15min，洗脫15min，結(jié)扎左冠狀動脈前降支30min，再灌注前1min吸入2

12、.5％七氟醚5min，再灌注2h。
　　 于再灌注2h時測定血清氧化物岐化酶(SOD)活性、心肌丙二醛(MDA)含量，血漿血小板最大聚集率、血栓素B2(TXB2)和6-keto-PGF1α的濃度，計算TXB2/6-keto-PGF1α;測定缺血區(qū)心肌組織MDA含量、SOD及Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶的活性；測定缺血區(qū)心肌細胞凋亡指數(shù)，采用免疫組化和原位雜交的方法測定凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的蛋白和mRNA的

13、表達。
　　 結(jié)果：
　　 1．與S組比較，I/R組血清及心肌組織SOD活性降低（P＜0.01），血清MDA濃度及心肌組織MDA含量升高（P＜0.05）；與I/R組比較，Spre組、Spo組及Spre+po組血清SOD濃度及心肌組織SOD活性升高(P＜0.05)，血清MDA濃度及心肌組織MDA含量降低(P＜0.05)；與Spre組和Spo組比較，Spre+po組血清SOD濃度及心肌組織SOD活性升高(P＜0.05)，血清

14、MDA濃度及心肌組織MDA含量降低（P＜0.05）；Spre組及Spo組組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 2．與S組比較，I/R組心肌細胞Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性降低；與I/R組比較，Spo、Spre組及Spre+po組心肌細胞Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性升高(P＜0.05)；與Spre組和Spo組比較，Spre+po組心肌細胞Na+-K+-ATP酶、C

15、a2+-Mg2+-ATP酶活性升高(P＜0.05)，Spre組及Spo組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 3．各組間血漿TXB2、6-keto-PGF1α濃度、TXB2/6-keto-PGF1α及血小板最大聚集率的比較與S組比較，I/R組TXB2、6-keto-PGF1α的水平、TXB2/6-keto-PGF1α和血小板最大聚集率升高(P＜0.05或0.01)；與I/R組比較，Spre組和Spo組TXB2/6-ket

16、o-PGF1α降低(P＜0.05或0.01)，6-keto-PGF1α的水平升高(P＜0.05或0.01)；與Spre組和Spo組比較，Spre+po組血漿TXB2、TXB2/6-keto-PGF1α和血小板最大聚集率降低(P＜0.05)，6-keto-PGF1α的水平升高(P＜0.05)。
　　 4．與S組比較，I/R組心肌細胞凋亡指數(shù)升高，Bcl-2蛋白、Bax蛋白及Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達均上調(diào)(P＜0.

17、05)；與I/R組比較，Spo組、Spre組及Spre+po組心肌細胞凋亡指數(shù)降低，Bax蛋白及Bax mRNA表達下調(diào)(P＜0.05)，Bcl-2蛋白及Bcl-2 mRNA表達上調(diào)(P＜0.05)，Bcl-2/Bax升高(P＜0.05)。與Spre組和Spo組比較，Spre+po組凋亡指數(shù)降低，Bax蛋白及Bax mRNA表達下調(diào)(P＜0.05)，Bcl-2蛋白及Bcl-2mRNA表達上調(diào)(P＜0.05)，Bcl-2/Bax升高(P＜

18、0.05)。Spo組、Spre組組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1．七氟醚預(yù)處理聯(lián)合后處理可通過提高SOD活性，清除氧自由基，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而減輕心肌缺血再灌注損傷。
　　 2．七氟醚預(yù)處理聯(lián)合后處理能提高心肌細胞Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶的活性，從而減輕心肌缺血再灌注損傷。
　　 3．七氟醚預(yù)處理聯(lián)合后處理可抑制TXA2的釋放和促進PGI2的合成，

19、從而減輕了大鼠心肌缺血再灌注損傷。
　　 4．七氟醚預(yù)處理聯(lián)合后處理通過上調(diào)Bcl-2的表達，抑制Bax的表達，從而改善了Bcl-2/Bax，抑制了心肌細胞的凋亡，進一步減輕了心肌缺血再灌注損傷。
　　 第三部分 PI3K-Akt-eNOS轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在七氟醚后處理減輕大鼠急性心肌缺血再灌注損傷中的作用
　　 目的：評價PI3K-Akt-eNOS轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在七氟醚后處理減輕大鼠急性心肌缺血再灌注損傷中的作用。
　

20、　 方法：健康雄性Wistar大鼠75只，體重250～280g，采用隨機數(shù)字表法，將大鼠隨機分為5組（n=15）。(1)假手術(shù)組(S)頸部切開，氣管插管，開胸，左冠狀動脈前降支下穿線，不結(jié)扎。(2)缺血再灌注組(I/R)結(jié)扎左冠狀動脈前降支30min，再灌注2h制備大鼠心肌缺血再灌注模型，缺血前后及再灌注前后不再給予其他干預(yù)。(3)七氟醚后處理組(Spo組)制備大鼠心肌缺血再灌注模型，再灌注前1min吸入2.5％七氟醚5min。(4)

21、七氟醚后處理聯(lián)合LY294002組(Spo+LY組)LY294002是選擇性的PI3K抑制劑，制備大鼠心肌缺血再灌注模型，由另一術(shù)者于再灌注前5min經(jīng)大鼠股靜脈給藥LY294002(0.3mg/kg)。再灌注前1min給予2.5％七氟醚持續(xù)吸入5min，(5)七氟醚后處理聯(lián)合DMSO組(Spo+DMSO組)制備大鼠心肌缺血再灌注模型，再灌注前5min經(jīng)大鼠股靜脈給藥給予0.02％DMSO(與Spo+LY組等容積)，不含有LY29400

22、2，再灌注前1min給予2.5％七氟醚持續(xù)吸入5min。分別于左冠狀動脈前降支穿線并穩(wěn)定10min(preischemia)、再灌注2h末測定左室收縮壓(LVSP)、左室舒張末壓(LVDEP)、左室內(nèi)壓上升/下降的最大速率(±dp/dtmax)，計算左室發(fā)展壓(LVDP=LVSP-LVDEP)。再灌注2h后，測定血清磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)和乳酸脫氫酶(LDH)的活性及心肌肌鈣蛋白I(cTnI)的濃度。每組隨機取5只大鼠的左室心

23、肌組織，計算缺血危險區(qū)體積和梗死區(qū)體積占左室體積百分比。再灌注15min時，取缺血危險區(qū)心肌組織，采用Western Blot法測定Akt、eNOS蛋白表達及其磷酸化水平。
　　 結(jié)果：
　　 1．各組大鼠LVDP、±dp/dtmax的比較各組preischemia LVDP、±dp/dtmax比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與S組比較，I/R組LVDP、±dp/dtmax降低；與I/R組比較，Spo組、Spo+DMSO組LVDP

24、、±dp/dtmax升高；與Spo組比較，Spo+LY組LVDP、±dp/dtmax降低。除S組外，各組組內(nèi)與preischemia比較，LVDP、±dp/dtmax降低。
　　 2．各組間血清CK-MB和LDH活性及cTnI濃度的比較與S組比較，I/R組血清CK-MB和LDH活性及cTnI濃度升高(P＜0.05或0.01)；與I/R組比較，Spo組血清CK-MB和LDH活性及cTnI濃度降低(P＜0.05或0.01)，Spo+

25、LY組血清CK-MB和LDH活性及cTnI的濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；與Spo組比較，Spo+LY組血清CK-MB和LDH活性及cTnI濃度升高(P＜0.01)。
　　 3．各組大鼠心肌梗死區(qū)體積的比較各組相比缺血區(qū)體積差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。與I/R組相比，Spo組心肌梗死區(qū)體積明顯減小(P＜0.05)；Spo+LY組心肌梗死區(qū)體積差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與Spo組比較，Spo+LY組心肌梗死區(qū)

26、體積增加(P＜0.05)；Spo+LY組與I/R組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 4．任兩組間總Akt(t-Akt)及eNOS水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。與I/R組比較，Spo組p-Akt和其下游p-eNOS水平顯著增加（p-Akt/t-Akt:Spo.vs.I/R:0.69±0.04vs.0.35±0.03,P＜0.05;p-eNOS/t-eNOS Spo.vs.I/R:0.73±0.03vs.0.54

27、±0.01，P＜0.05）。給予LY294002后可阻斷Akt及eNOS磷酸化(p-Akt/t-Akt:Spo.vs.LY:0.69±0.04vs.0.41±0.02，P＜0.05;p-eNOS/eNOSSpo.vs.LY:0.73±0.03vs0.58±0.02，P＜0.05)。Spo+LY組與I/R組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 結(jié)論：PI3K-Akt-eNOS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活可能是七氟醚后處理減輕大鼠急性