蚯蚓蛋白酶解工藝與氨基酸螯合鹽的制備及生物效應研究.pdf

1、蚯蚓蛋白資源化利用，已由原單方向的飼料化利用轉向了多功能產(chǎn)品的開發(fā)利用。氨基酸螯合金屬鹽的制備是涉及到氨基酸的制備，螯合物的合成及后期產(chǎn)物生物效應檢測(bioassay)的系統(tǒng)工作，螯合鹽在微量元素肥料、液體肥料、動物飼料添加劑、種子包衣劑生產(chǎn)中的運用相當廣泛。 本研究利用蚯蚓蛋白作為氨基酸供體，對比了蚯蚓自溶和添加外源蛋白酶水解產(chǎn)率的變化，并引入響應面(RSM)設計優(yōu)化酶解條件，篩選出螯合銅、鋅鹽的最佳螯合條件，最后通過生物檢

2、測，即小麥發(fā)芽率試驗和小麥種芽敏感性試驗，檢驗FeSO4，EDTA-Fe，AA-Fe三種鐵鹽的生物效應，評價了三種鐵鹽的對小麥種芽相關部位和功能體的靶位作用。主要研究結果和結論如下： 1.整個水解過程中酸性蛋白酶處理的氨基態(tài)氮濃度都明顯高于自溶處理，差異顯著，從3h到8h時，加酶處理水解度由12.7％提高到22％，自溶處理水解度由6.62％提高到16.05％，同時酸性蛋白酶相對于自溶處理的水解度提高率由91.8％下降到37.1％

3、。 2.水解時間X和氨基態(tài)氮濃度Y進行擬合，酸性蛋白酶處理與自溶處理方程分別為：Y=0.432×exp(0.130X)；Y=0.260×exp(0.143X)，模型的相關系數(shù)分別為0.9383*，0.9928*。自溶模型擬合度低于加酶處理模型，蚯蚓自溶過程是一個不穩(wěn)定的反應過程。 3.生產(chǎn)工藝中原材料的保存方式對后期酶解工藝的影響甚為重要，4℃和25℃條件保存及放置時間對后期蚯蚓自溶工藝的水解率產(chǎn)生了顯著的影響，4℃存放

4、蚯蚓勻漿物在相同放置時間內(nèi)水解率均大于25℃的水解率，兩者差異顯著。4℃條件下存放有利于后期酶解流程中水解率的提高，存放時間不宜超過4h。 4.編碼值溫度(A)、酶濃度(B)、酶解時間(C)的響應面分析試驗，利用DesignExpert7.1回歸分析，得到水解率預測值(Y)對編碼自變量A，B，C的回歸方程為：Y=22.86+1.66A+1.83B+0.92C+1.23AB-0.70AC-0.55BC+1.58A2+0.2482-

5、0.5C2，系數(shù)顯著性檢驗后模型修正：Y=22.86+1.66A+1.83B+1.58A2，模型中A，B，C求偏導，得出最佳條件：溫度=50℃，酶濃度=5％，酶解時間=4.34h。 5.銅螯合的最佳條件：溫度40℃，時間30min，質(zhì)量比2:1；鋅離子螯合的最佳條件：溫度30℃，時間50min，質(zhì)量比2:1。 6.發(fā)芽率是生物檢測的常用方法，AA-Fe在10-100mg·L-1，對小麥發(fā)芽率的促進和抑制均不明顯，250m

6、g·L-1的發(fā)芽抑制率突然提高。鐵鹽的品種不同對小麥根長的抑制程度不同，超過100mg·L-1，三種鐵鹽均抑制伸長和質(zhì)量，抑制率AA-Fe最高。 7.三種鐵鹽濃度與發(fā)芽指數(shù)(GI)間的曲線模型可分析評估三種鐵鹽的生物活性，三類鐵鹽模型分別為lnY=ln(99.6378)-0.01627X，Y=97.16-42.2889Lgx+8.588(lgx)2，Y=99.46-40.47lgx(X：鐵鹽濃度，Y：發(fā)芽指數(shù))。 8.小

7、麥種芽對鐵鹽的影響尤為敏感，最為直觀的反應為芽葉與根的生物量和伸長度的變化。根在形態(tài)與質(zhì)量上響應敏感度高于芽。濃度大于100mg·L-1時，三種鐵鹽對根與芽葉的伸長，鮮重均產(chǎn)生不同程度的抑制，其中以AA-Fe的抑制程度最高，三種鐵鹽根伸長抑制率AA-Fe>FeSO4>EDTA-Fe。 9.從鐵鹽對小麥光合系統(tǒng)影響角度分析，AA-Fe的對小麥的抑制起始濃度在50-100mg·L-1之間，F(xiàn)eSO4與EDTA-Fe對小麥的抑制起始濃

8、度在100-250mg·L-1之間。三種鐵鹽對葉綠素的抑制性AA-Fe最強，其次為FeSO4，EDTA-Fe最小。 10.芽葉和根MDA濃度應鐵鹽品種和濃度的變化而變化，F(xiàn)eSO4與EDTA-Fe處理的芽葉和根中MDA的濃度隨鐵鹽濃度提高先上升，后稍有下降，芽葉MDA變化幅度分別為-41.32％-172％和24.31％-148.96％，根MDA變化幅度分別為75％-571％和90.78％-285.82％；AA-Fe處理的芽葉和根

9、中MDA的濃度隨鐵鹽濃度而提高，變化范圍分別為26.04％-103.82％和21％-652.48％，MDA在根中變化幅度大于芽葉。 11.測定指標對于鐵鹽濃度的響應度上，抑制率指標>脂膜過氧化指標>葉綠素指標，生長指標(抑制率指標)的響應度高于生理指標(葉綠素指標、脂膜過氧化指標)。FeSO4作用靶位主要為芽，EDTA-Fe與AA-Fe作用靶位主要為根；小麥根脂膜系統(tǒng)對FeSO4和AA-Fe的響應度高，幼芽脂膜系統(tǒng)對EDTA-F