重金屬銅單克隆抗體研制及銅、汞單鏈抗體三維結(jié)構(gòu)模擬.pdf

1、重金屬是有毒并對(duì)環(huán)境有著持久污染的物質(zhì)，重金屬可以在生物體內(nèi)長(zhǎng)期積累不可降解，在環(huán)境中可長(zhǎng)時(shí)間結(jié)合在土壤或沉淀物中，隨著環(huán)境的變化使金屬發(fā)生移動(dòng)，大大提高了它們的毒性和可吸收性。因此重金屬在環(huán)境、農(nóng)產(chǎn)品中殘留檢測(cè)都是非常重要的。
　　 本研究制備抗重金屬銅雜交瘤細(xì)胞株，在對(duì)其親和力、特異性進(jìn)行鑒定的基礎(chǔ)上，克隆抗重金屬銅、汞單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，構(gòu)建抗重金屬單鏈抗體基因，利用軟件分析抗銅和抗汞單鏈抗體(ScFv)二級(jí)

2、結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)。
　　 銅離子通過(guò)雙功能螯合劑與血藍(lán)蛋白(KLH)的偶聯(lián)物作為免疫原，免疫BALB/c鼠。采用雜交瘤技術(shù)建立能穩(wěn)定分泌高親和力抗重金屬銅單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，大量制備獲得純化的單克隆抗體，間接ELISA法檢測(cè)效價(jià)，非競(jìng)爭(zhēng)酶免疫實(shí)驗(yàn)測(cè)定親和力，競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定抗體的特異性。確定抗原抗體的最佳組合，通過(guò)對(duì)離子強(qiáng)度、pH值優(yōu)化等研究，確定酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)的最佳工作參數(shù)，建立定量測(cè)定金屬離子的間接競(jìng)

3、爭(zhēng)ELISA方法。
　　 選用Trizol試劑提取總RNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)利用重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通用引物，擴(kuò)增抗體可變區(qū)基因。通過(guò)重疊延伸PCR(SOE-PCR)將兩個(gè)可變區(qū)基因通過(guò)連接肽基因連接起來(lái)，構(gòu)建單鏈抗體基因，克隆到T載體中，通過(guò)PCR和測(cè)序進(jìn)行鑒定。
　　 在Discovery Studio軟件服務(wù)器上，利用同源蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的方法模建單鏈抗體分子結(jié)構(gòu)，建立其三維結(jié)構(gòu)模型，運(yùn)用分子生物學(xué)、

4、分子動(dòng)力學(xué)，驗(yàn)證三維結(jié)構(gòu)的合理性。
　　 采用雜交瘤技術(shù)建立能穩(wěn)定分泌高親和力抗汞單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，選用汞單克隆抗體30，用Trizol試劑提取總RNA，通過(guò)RT-PCR，采用小鼠重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通用引物，擴(kuò)增抗體可變區(qū)基因。通過(guò)重疊延伸PCR(SOE-PCR)將兩個(gè)可變區(qū)基因通過(guò)連接肽基因連接起來(lái)，構(gòu)建單鏈抗體基因，克隆到pGEM-T載體中，通過(guò)酶切、PCR和測(cè)序進(jìn)行鑒定。
　　 在Discovery S

5、tudio軟件服務(wù)器上，利用同源蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的方法模建單鏈抗體分子結(jié)構(gòu)，建立其三維結(jié)構(gòu)模型，運(yùn)用分子生物學(xué)、分子動(dòng)力學(xué)，驗(yàn)證三維結(jié)構(gòu)的合理性。
　　 成功建立了三株能穩(wěn)定分泌抗銅單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，獲得了高純度的單克隆抗體，選親和力高的抗體建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，抗體DF4的IC50分別為0.671μg/mL,銅最低檢出濃度為0.014μg/mL，自來(lái)水、超純水等水樣中重金屬標(biāo)準(zhǔn)液的添加回收率介于為81.8-111.5％。從抗銅雜交