丙烯酰胺對雄性動物生殖及成體干細胞的毒理學研究.pdf

1、目前,已知丙烯酰胺(Acrylamide)是一種二類致癌物質,并具有神經毒性、遺傳毒性和生殖毒性。在瑞典科學家公布油炸、燒烤和烘焙類食品中含丙烯酰胺后,其公共衛(wèi)生安全問題開始備受關注。
　　 丙烯酰胺職業(yè)性接觸主要見于生產聚丙烯酰胺等的合成過程；丙烯酰胺是生產和合成聚丙烯酰胺過程中形成的一種中間化學物質,廣泛應用于飲用水凈化、城市污水和工業(yè)廢水處理、油井工藝、建筑行業(yè)、造紙工業(yè)、飼料加工,土壤穩(wěn)定劑以及化妝品、日用化學品添加劑、

2、生物工程學試驗等,同時,它還存在于煙草燃燒的煙霧中(這證明它能在生物原料的加熱過程中形成).
　　 日常生活中,丙烯酰胺可見于使用化妝品、吸煙、經高溫加工處理的淀粉類食品及飲用水中。丙烯酰胺可通過皮膚、口腔或呼吸道進入生物體內在,一旦進入體內,它可以快速分布于全身的組織中。孕婦接觸丙烯酰胺,其可以通過血液進入胎兒.雄性動物攝入一定量丙烯酰胺可影響生殖能力。2010年3月,歐洲化學品管理局(ECHA)在高度關注物質(SVHC)清單

3、中新增了一項物質,即丙烯酰胺。
　　 近幾年,關于丙烯酰胺毒性機制的探討不斷深入,其生殖毒性的研究需要進行更大范圍的研究和論證,本試驗以大鼠為模式動物研究其體內生殖毒性,以大鼠和五指山小型豬骨髓間充質干細胞為細胞模型研究其體外細胞毒性,并探討丙烯酰胺的生殖毒性和細胞毒性機制。
　　 1、口服丙烯酰胺對大鼠生長發(fā)育及生殖的影響
　　 本試驗首先研究丙烯酰胺對雄性大鼠的生長發(fā)育與生殖毒性作用。選30只21日齡斷奶未成

4、熟SD雄性大鼠,隨機分為3組。處理組Ⅰ和處理組Ⅱ分別通過自由飲水方式口服5mg/kg/d和10mg/kg/d的丙烯酰胺溶液8周,對照組口服蒸餾水.分別在第4周和第8周時對日增重、體重、臟器重等指標進行檢測,并做睪丸和附睪及各臟器的組織形態(tài)學觀察；在第8周時,同時檢查附睪尾精子密度和精子頂體形態(tài)。結果顯示,兩處理組大鼠體增重顯著低于對照組(P<0.05)；至試驗結束時,睪丸、附睪發(fā)育受到影響；處理組Ⅱ大鼠附睪尾部精子密度顯著低于對照組(P

5、<0.05),處理組Ⅰ與對照組差異不顯著(P>0.05)；睪丸出現不同程度的病理變化,曲細精管內生精細胞發(fā)生部分缺失。試驗表明,丙烯酰胺可阻滯大鼠生長,影響性器官發(fā)育,對生精小管和間質細胞產生毒性作用而導致雄性大鼠附睪尾部精子密度降低。
　　 2、口服丙烯酰胺對大鼠生殖毒理機制的研究
　　 為進一步探討丙烯酰胺的雄性生殖毒性機理,本試驗對亞慢性染毒處理組I(5mg/kg/d)和處理組Ⅱ(10 mg/kg/d)的大鼠進行血

6、清總睪酮測定,對睪丸和附睪病理組織切片形態(tài)學、免疫組織化學進行分析,計算處理組與對照組單位面積內的間質細胞數目,應用TissueGnostics全景組織體細胞定量分析儀對病理組織免疫組織化學圖片做定量分析,對處理組與對照組大鼠附睪內sGCα1蛋白表達做全組織分析掃描。結果顯示,丙烯酰胺亞慢性處理組Ⅱ中大鼠血清中總睪酮含量與對照組相比顯著升高(P<0.05)；曲細精管周圍間質細胞增生異常,與對照組相比差異顯著(P<0.05),處理組Ⅰ與其

7、它兩組相比差異不顯著；處理組Ⅱ中大鼠病理睪丸組織內間質細胞sGCα1蛋白表達量低于對照組,而sGCβ1表達量無明顯差異；各組附睪全景組織體掃描分析結果顯示,各組間附睪中sGCα1與sGCβ1表達量無明顯差異,但是附睪頭、尾部sGCα1表達強度較體部強烈。試驗表明,丙烯酰胺的生殖毒性作用機制可能是通過NO/sGc/cGMP通路中的sGC蛋白,影響大鼠睪丸生精小管內緊密連接結構,使生精細胞發(fā)生缺失,從而導致精子密度降低；同時sGC異二聚體在

8、睪丸和附睪內的差異性表達暗示二者在精子發(fā)生與類固醇激素合成過程中起著不同的生理作用。
　　 3、丙烯酰胺對大鼠骨髓間充質干細胞成骨分化能力的影響
　　 為研究丙烯酰胺對大鼠骨髓間充質干細胞的細胞毒性作用,本試驗從1月齡SD大鼠股骨、脛骨中分離、純化出大鼠骨髓間充質干細胞,并通過成骨分化和細胞表面抗原進行鑒定。丙烯酰胺處理組細胞在基礎培養(yǎng)基中添加0、5、100、300、1000μM濃度的丙烯酰胺,連續(xù)培養(yǎng)8天,觀察丙烯酰胺

9、對細胞形態(tài)變化,應用CCK-8法檢測繪制細胞生長曲線,計算細胞增殖抑制率。在成骨分化21天過程中添加0、5、25、100、200、300μM濃度的丙烯酰胺,茜素紅、堿性磷酸酶染色檢測丙烯酰胺對成骨分化的影響。試驗結果表明,丙烯酰胺可導致大鼠骨髓間充質干細胞形態(tài)發(fā)生改變,濃度為5、100、300、1000μM的丙烯酰胺對細胞生長的抑制率分別為7.69％、30.77％、53.85％和100％；對照組、5、100、300μM丙烯酰胺處理組大鼠

10、骨髓間充質干細胞細胞倍增時間分別為:72、79.7、88.1和111.2小時。隨丙烯酰胺濃度增大細胞成骨分化受抑制程度明顯,堿性磷酸酶表達量降低且極顯著(P<0.01)。表明丙烯酰胺抑制大鼠骨髓間充質干細胞增殖及其向成骨分化。
　　 4、丙烯酰胺對五指山小型豬骨髓間充質干細胞細胞增殖毒理的機制研究
　　 為研究丙烯酰胺對骨髓間充質干細胞增殖毒性的作用機制,本試驗從6日齡五指山小型豬股骨中分離、純化骨髓間充質干細胞,并通過

11、成骨、成脂肪分化進行鑒定。丙烯酰胺處理組在基礎培養(yǎng)基中添加0、50、100、500、1000μM的丙烯酰胺,處理1小時后,檢測細胞中活性氧(ROS)與總谷胱甘肽過氧化物酶含量。連續(xù)處理3天后,觀察細胞形態(tài),應用微絲綠色熒光探針檢測細胞骨架變化,同時提取RNA,檢測細胞骨架actin基因表達變化。結果顯示:丙烯酰胺處理組細胞內ROS含量隨丙烯酰胺濃度升高而升高,500、1000μM處理組與對照組相比差異顯著(P<0.05)；總谷胱甘肽過氧

12、化物酶含量降低,與對照組相比差異顯著(P<0.05)；丙烯酰胺500、1000μM處理組細胞骨架內微絲發(fā)生重排,細胞形態(tài)變圓,微絲縮短；定量PCR結果顯示1000μM組細胞骨架actin基因表達量下調顯著(P<0.05)；丙烯酰胺50、100μM處理組的上述檢測指標與對照組相比差異不顯著(P>0.05)。試驗表明,高濃度丙烯酰胺可致五指山豬骨髓間充質干細胞形態(tài)發(fā)生變化,并影響其活性氧代謝,細胞骨架縮短,從而對細胞增殖能力產生影響。

13、>　　 綜上所述,體內試驗表明,丙烯酰胺可阻滯斷奶期大鼠生長,致使大鼠體重日增重下降。丙烯酰胺可引起大鼠附睪尾部精子密度下降,可能是丙烯酰胺通過NO/sGC/cGMP通路作用,影響大鼠睪丸生精小管緊密連接結構,致使生精小管內生精細胞發(fā)生耗竭,間質細胞增生與大鼠體內激素升高可能機體內精子發(fā)生過程中的代償作用；體外試驗結果表明,丙烯酰胺中、高劑量處理組細胞內ROS累積,細胞骨架微絲變短,導致細胞增殖能力降低。堿性磷酸酶活性降低,細胞形態(tài)發(fā)