Curcumin通過增強Rab7表達促進自噬體的軸突運輸.pdf

1、目的：
　　阿爾茨海默?。ˋD）是一種起病隱匿的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性變性疾病。自噬作為一種真核細胞內(nèi)重要的蛋白質(zhì)降解途徑，與AD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。自噬體大量堆積在軸突末端不能與溶酶體結(jié)合不僅影響了Aβ的代謝，更容易引起自噬應(yīng)激導致神經(jīng)細胞死亡。Rab7是一種小GTP酶，在自噬體的成熟以及自噬體與溶酶體的融合中都發(fā)揮著重要作用。研究表明，curcumin（姜黃素）作為一種多酚類植物化合物，在AD中起神經(jīng)保護作用，但其作用機制尚有待進

2、一步研究。本研究擬通過體外研究的方法，首先驗證curcumin減少Aβ的沉積以及對AD的神經(jīng)保護作用；再觀察curcumin對自噬及自噬流的影響；緊接著進一步研究其對自噬體軸突運輸?shù)淖饔茫蛔詈筇接懫渥饔脵C制是否與Rab7的表達有關(guān)。本研究選擇一個新的視角探討curcumin對AD的作用機制，為AD的治療提供新的靶點、新的思路。
　　方法：
　　首先將細胞分為4組：WT組（N2a/WT細胞）、Control組（N2a/APP6

3、95swe細胞）、Sham組（經(jīng)5μM DMSO溶液處理24h的N2a/APP695swe細胞）、Curcumin組（經(jīng)5μM curcumin溶液處理24h的N2a/APP695swe細胞）。流式細胞術(shù)用于檢測各組細胞凋亡率和線粒體膜電位的變化。ELISA實驗用于檢測各組細胞上清液中Aβ的表達。通過透射電鏡和激光共聚焦顯微鏡進一步觀察各組細胞中自噬體及自噬溶酶體數(shù)量的變化，并運用Western Blot檢測LC3II、SQSTM1、B

4、eclin1、Atg7、Atg16L1、Dynein、KIF3B以及Rab7的表達。qRT-PCR用于檢測 Rab7在分子水平的表達。然后進一步在 N2a/APP695swe細胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1、pcDNA3.1-Rab7、NC-siRNA、Rab7-siRNA后，將細胞分為5組：Control組、pcDNA3.1組、pcDNA3.1-Rab7組、NC-siRNA組、Rab7-siRNA組，再次用流式細胞術(shù)檢測各組中細胞凋亡率和線

5、粒體膜電位的變化，ELISA檢測各組中Aβ的表達，透射電鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察各組細胞中自噬體及自噬溶酶體數(shù)量的變化，Western Blot檢測LC3II、SQSTM1、Dynein、KIF3B蛋白的表達情況。
　　結(jié)果：
　　與Control組相比，經(jīng)curcumin處理細胞24h后，細胞凋亡率明顯降低（P=0.000），線粒體膜電位升高（P=0.000），細胞上清液中Aβ的含量減少（P=0.000）；透射電鏡和激光共

6、聚焦顯微鏡均顯示自噬體增加，且自噬溶酶體數(shù)量也增加；Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)LC3II、Beclin1、Atg7、Atg16L1、Dynein以及Rab7的表達均增多（P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.003；P=0.000；P=0.000），而SQSTM1和KIF3B的表達降低（P=0.000；P=0.000）；qRT-PCR結(jié)果顯示Rab7在mRNA水平表達也有所增加（P=0.000）。在N2a/APP

7、695swe細胞中轉(zhuǎn)染Rab7過表達載體后，與Control組相比，細胞凋亡率降低（P=0.000），線粒體膜電位增加（P=0.000），細胞上清液中Aβ的含量減少（P=0.000）；透射電鏡和激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示自噬體和自噬溶酶體數(shù)量也增加；Western Blot結(jié)果表明雖然LC3II的表達無明顯差異（P=0.865），但SQSTM1表達明顯減少（P=0.000），Dynein和KIF3B的表達有所增加（P=0.000；P=0.