新型磷酯酰絲氨酸受體Tim-3介導(dǎo)凋亡細胞吞噬關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域的研究.pdf

1、研究背景：
　　 吞噬細胞吞噬凋亡細胞是機體清除衰老細胞及受損細胞、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要機制。凋亡細胞清除障礙在多種自身免疫病發(fā)生中發(fā)揮重要作用。細胞凋亡時，磷酯酰絲氨酸(PtdSer,PS)從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到表面，暴露在細胞外環(huán)境中，繼而被吞噬細胞表面的磷脂酰絲氨酸受體(PSR)識別并介導(dǎo)吞噬凋亡細胞，同時引起抗炎細胞因子（如TGF-β等）的釋放。而未被清除的凋亡細胞會積聚誘發(fā)(“)二次壞死(”)，細胞質(zhì)膜破裂釋放出大量內(nèi)容

2、物，如核小體碎片、DNA、蛋白質(zhì)、組蛋白成分，引發(fā)炎癥反應(yīng)及自身免疫性疾病。因此，對于新型PSR結(jié)構(gòu)與功能的研究成為目前的研究熱點。
　　 吞噬細胞表面PSR識別磷酯酰絲氨酸是凋亡細胞吞噬過程中的關(guān)鍵。Masafumi等發(fā)現(xiàn)Tim-3(Tcellimmunoglobulinandmucindomain-containingmolecule-3)可以介導(dǎo)凋亡細胞的吞噬，是一種新型磷脂酰絲氨酸受體。Tim-3是Ⅰ型跨膜糖蛋白，人與鼠

3、Tim-3分子氨基酸序列含有63％的同源性，均包括可變區(qū)結(jié)構(gòu)域(IgV)、含糖基化位點的粘蛋白樣結(jié)構(gòu)域(Mucindomain)、跨膜結(jié)構(gòu)域(Transmembranedomain)及含酪氨酸磷酸化基序的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(Cytoplasmictail)。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠Tim-3分子IgV結(jié)構(gòu)域的CC'及FG環(huán)能識別磷酯酰絲氨酸，是吞噬細胞吞噬凋亡細胞的重要步驟，且小鼠Tim-3分子IgV結(jié)構(gòu)域中112位點精氨酸位點(R112)突變?yōu)楸彼?

4、A)后(R112A)能抑制Tim-3與凋亡細胞的結(jié)合，提示該位點在Tim-3介導(dǎo)的凋亡細胞吞噬中具有關(guān)鍵性作用。與體外實驗結(jié)果相符，動物實驗證實，小鼠Tim-3能促進體內(nèi)凋亡細胞的清除;阻斷性Tim-3mAb處理導(dǎo)致自身免疫病模型小鼠脾淋巴結(jié)凋亡細胞及血清anti-dsDNA的增多;且高表達Tim-3的小鼠CD8+DC不僅促進凋亡細胞的吞噬，還增加對CD8+T細胞的交叉遞呈作用并抑制炎癥反應(yīng)。上述研究強烈提示Tim-3在凋亡細胞的清除、

5、抑制自身免疫病的發(fā)生及維持免疫耐受中發(fā)揮重要作用。然而，人Tim-3(hTim-3)介導(dǎo)凋亡細胞吞噬的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是什么，其功能結(jié)構(gòu)域及內(nèi)部信號機制迄今尚未見報道。
　　 研究目的：
　　 構(gòu)建能有效表達主要結(jié)構(gòu)域缺失及點突變的人Tim-3(hTim-3)真核表達載體，轉(zhuǎn)染及吞噬實驗確定Tim-3介導(dǎo)凋亡細胞吞噬的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，為闡明Tim-3介導(dǎo)吞噬凋亡細胞機制、尋找相關(guān)自身免疫病潛在治療靶點提供理論基礎(chǔ)。
　　 研

6、究方法及結(jié)果：
　　 1.成功建立可以有效表達主要功能域缺失及點突變的hTim-3真核表達載體
　　 以本實驗室保存質(zhì)粒pcDNA3-hTim-3為模板，設(shè)計引物，PCR擴增Tim-3相應(yīng)片段目的基因，經(jīng)HindⅢ、XhoⅠ酶切回收后，克隆入pcDNA3相應(yīng)位點，構(gòu)建含HA-tag融合基因的各種人Tim-3(hTim-3)表達載體。構(gòu)建載體包括人Tim-3全長（hTim-3-FL）、IgV區(qū)缺失(△IgV)、粘蛋白功能域

7、缺失(△mucin)、胞內(nèi)段缺失(△cyto)、胞內(nèi)段截短T1(aa1-aa277)、T2(aa1-aa264)及主要酪氨酸磷酸化位點點突變(R111A、Y265F、Y272F、Y265/272F)載體。上述載體經(jīng)雙酶切及測序鑒定證實構(gòu)建成功。
　　 利用lipo2000將上述載體DNA轉(zhuǎn)染至對數(shù)期生長的HEK293細胞，48h后收集細胞，分別抽提RNA及總蛋白，RT-PCR及Westernblot檢測目的基因表達。RT-PCR

8、結(jié)果顯示各載體均介導(dǎo)相應(yīng)片段Tim-3mRNA在HEK293細胞表達。HA抗體Westernblot結(jié)果證實所有載體均可介導(dǎo)不同長度Tim-3-HA融合蛋白表達;Tim-3抗體Westernblot結(jié)果顯示，除△mucin外，各載體轉(zhuǎn)染后的HEK293細胞中均出現(xiàn)兩條特異性條帶，推測分子量大的一條為糖基化修飾蛋白。
　　 2.成功建立凋亡細胞吞噬體系
　　 2.1.地塞米松誘導(dǎo)胸腺細胞凋亡
　　 分離4到6周齡B

9、ALB/c鼠胸腺細胞，以1×107/ml細胞種于6孔板，在不含血清的DMEM培養(yǎng)基條件下加入10μM地塞米松(Dex)處理4h誘導(dǎo)凋亡。收取細胞，3000rpm×5min，PBS洗滌兩次，以Annexin(V)及PI染色后檢測凋亡率。流式結(jié)果發(fā)現(xiàn)地塞米松(Dex)成功誘導(dǎo)胸腺細胞凋亡，早期凋亡率為(46.53±4.18)％，顯著高于對照組(P＜0.01)。
　　 2.2.以HEK293細胞為模型成功建立凋亡細胞吞噬體系
　

10、　 同上制備凋亡細胞，以0.1μg/mlPHrodo-SE標記后按20∶1的比例與轉(zhuǎn)染hTim-3-FL載體的HEK293細胞共孵育90min。之后胰酶消化細胞并離心，以300μlCHES-FACSbuffer重懸，分別進行熒光顯微鏡觀察及流式檢測。熒光顯微鏡觀察顯示，hTim-3-FL過表達HEK293細胞可以有效吞噬凋亡細胞，吞噬后凋亡細胞因酸性環(huán)境顯紅色熒光，而未被吞噬的凋亡細胞因PH＞7沒有熒光，提示，以HEK293細胞為模型

11、成功建立了吞噬凋亡細胞體系，且轉(zhuǎn)染hTim-3-FL使得HEK293細胞增強了吞噬凋亡細胞的能力。流式檢測結(jié)果驗證了上述結(jié)果:轉(zhuǎn)染空載體(pcDNA3)HEK293細胞只能吞噬少量凋亡細胞，而過表達hTim-3-FL的HEK293細胞能夠有效吞噬凋亡細胞，吞噬率達到38％以上，二者相比有顯著性差異(P＜0.01)。
　　 3.hTim-3分子介導(dǎo)吞噬凋亡細胞功能域的確定
　　 為確定人Tim-3(hTim-3)蛋白中介導(dǎo)

12、吞噬凋亡細胞的關(guān)鍵功能域，分別將構(gòu)建的不同功能域缺失及突變hTim-3表達載體轉(zhuǎn)染HEK293細胞，同上與PHrodo-SE標記的凋亡細胞孵育后，流式細胞術(shù)測定HEK293吞噬凋亡細胞能力，分析hTim-3功能域?qū)ν淌傻蛲黾毎挠绊懀Y(jié)果如下:
　　 3.1.缺失IgV或Mucin結(jié)構(gòu)域的hTim-3失去促吞噬功能
　　 hTim-3缺失胞外段結(jié)構(gòu)域IgV(△IgV)或mucin(△mucin)之后，其吞噬率分別為(8.

13、85±2.93)％、(2.77±2.54)％，與對照組(3.44±2.96)％相比無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 3.2.R111位點是hTim-3促吞噬作用的關(guān)鍵位點
　　 文獻報道，小鼠Tim-3分子的R112位點能夠識別磷酯酰絲氨酸(PtdSer)[15]。與此相符，人Tim-3相應(yīng)R111位點突變后(R111A)，其吞噬率與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)意義。提示hTim-3蛋白的R111是識別PtdSer的主要位點。
　　

14、3.3.aa265-aa277是hTim-3胞內(nèi)段的有效功能片段
　　 hTim-3胞內(nèi)段含有6個酪氨酸位點(Y227、Y265、Y272、Y280、Y281、Y283)，為研究酪氨酸位點在Tim-3介導(dǎo)的凋亡細胞吞噬中的作用，構(gòu)建胞內(nèi)段截短載體——△cyto(aa1-aa224)、T1(aa1-aa277)、T2(aa1-aa264)，同上轉(zhuǎn)染HEK293細胞，構(gòu)建凋亡細胞吞噬體系。結(jié)果顯示，與hTim-3-FL相比，△cyt

15、o介導(dǎo)的凋亡細胞吞噬率顯著降低(P＜0.01);但T1介導(dǎo)的凋亡細胞吞噬率與hTim-3-FL相似(P＞0.05)，T2介導(dǎo)的凋亡細胞吞噬率則與△cyto無顯著差異。結(jié)果提示，hTim-3胞內(nèi)段在Tim-3介導(dǎo)的凋亡細胞吞噬中發(fā)揮重要作用，且胞內(nèi)段有效功能片段為aa265-aa277。
　　 3.4.凋亡細胞吞噬過程中發(fā)生了hTim-3胞內(nèi)段的酪氨酸磷酸化
　　 為研究酪氨酸磷酸化在hTim-3介導(dǎo)的凋亡細胞吞噬中的作用

16、。收集與凋亡細胞共孵育的hTim-3-FL或△cyto過表達HEK293細胞蛋白，anti-hTim-3抗體免疫沉淀后，磷酸化酪氨酸抗體(anti-PY)免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)，與hTim-3-FL轉(zhuǎn)染組相比，△cyto轉(zhuǎn)染組磷酸化酪氨酸水平明顯減少。提示酪氨酸的磷酸化參與Tim-3介導(dǎo)的凋亡細胞吞噬。
　　 3.5.Tim-3介導(dǎo)的凋亡細胞吞噬需要其胞內(nèi)Y265及Y272的協(xié)同作用
　　 aa265-aa277是hTim-3

17、介導(dǎo)凋亡細胞吞噬的關(guān)鍵胞內(nèi)片段，其中包含兩個酪氨酸磷酸化位點（Y265及Y272），分別對上述位點進行單獨突變及聯(lián)合突變(Y265F、Y272F、Y265/272F)并比較其介導(dǎo)的凋亡細胞吞噬率。結(jié)果顯示，兩個酪氨酸磷酸化位點單獨突變（Y265F及Y272F）并不影響hTim-3介導(dǎo)的對凋亡細胞的吞噬功能;而聯(lián)合突變Y265/272F則明顯減弱了hTim-3介導(dǎo)的對凋亡細胞的吞噬能力(P＜0.05)，但Y265/272F聯(lián)合突變組吞噬凋

18、亡細胞率仍顯著高于△cyto組(P＜0.05)。提示hTim-3介導(dǎo)的凋亡細胞吞噬需要其胞內(nèi)Y265及Y272位點協(xié)同作用，且除酪氨酸磷酸化外，推測其它氨基酸位點修飾同樣參與Tim-3介導(dǎo)的凋亡細胞吞噬信號傳導(dǎo)。
　　 4.hTim-3介導(dǎo)的凋亡細胞吞噬不依賴于ELMO/Dock180/Rac及GULP通路
　　 文獻顯示，磷酯酰絲氨酸受體介導(dǎo)凋亡細胞吞噬的信號傳導(dǎo)主要通過兩條經(jīng)典通路:ELMO/Dock180/Rac1

19、及胞漿接頭蛋白GULP，兩條通路最終均活化Rac1引起細胞骨架重排以吞噬凋亡細胞。然而RT-PCR檢測并未發(fā)現(xiàn)HEK293細胞中有通路分子ELMO的表達，且用GULPsiRNA干擾后并不影響hTim-3及△cyto介導(dǎo)的凋亡細胞吞噬率。提示Tim-3介導(dǎo)的凋亡細胞吞噬作用并不依賴于經(jīng)典的ELMO/Dock180/Rac1及GULP通路，其具體通路尚有待于進一步研究。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功構(gòu)建了不同截短片段及突變的

20、hTim-3系列表達載體，為深入研究Tim-3結(jié)構(gòu)與功能提供了重要實驗材料。
　　 2.成功建立凋亡細胞吞噬體系，為下一步的功能驗證奠定了實驗基礎(chǔ)。
　　 3.證實人Tim-3分子的胞外段結(jié)構(gòu)域尤其是R111位點在識別凋亡細胞并介導(dǎo)凋亡細胞吞噬中發(fā)揮重要作用;胞內(nèi)aa265-aa277片段是hTim-3介導(dǎo)吞噬凋亡細胞的關(guān)鍵胞內(nèi)功能片段，且Tim-3介導(dǎo)吞噬凋亡細胞依賴于其胞內(nèi)Y265及Y272的磷酸化及協(xié)同作用。

21、>　　 4.hTim-3介導(dǎo)凋亡細胞吞噬的信號傳導(dǎo)不依賴于經(jīng)典的ELMO/Dock180/Rac1及GULP途徑。
　　 創(chuàng)新性和意義：
　　 凋亡細胞的吞噬是目前研究熱點。Tim-3作為一種新型的PtdSer受體，在巨噬細胞及DC細胞中高表達，參與多種免疫性疾病發(fā)生。因此，研究Tim-3促凋亡細胞吞噬的機制具有重要意義。本課題首次證實了人Tim-3分子在介導(dǎo)凋亡細胞吞噬過程中的功能結(jié)構(gòu)域，為自身免疫病潛在治療靶點的選