簡(jiǎn)介：本論文包括兩部分1犬細(xì)小病毒CPV基因組克隆和生物學(xué)特性研究；2狂犬病病毒N基因的原核表達(dá)及應(yīng)用第一部分犬細(xì)小病毒病由犬細(xì)小病毒CPV引起，臨床癥狀以出血性腸炎和心肌炎為特征，是目前威脅養(yǎng)犬業(yè)的主要傳染病。犬細(xì)小病毒是一種線性單鏈DNA病毒，全長(zhǎng)基因組為5323BP，由兩個(gè)開放的讀碼框編碼2個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和2個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，為自主復(fù)制的細(xì)小病毒。本研究首先從發(fā)病犬的糞便中分離獲得了一株北京地區(qū)2004年流行的CPV病毒株，命名為CPVB2004，根據(jù)GENBANK已發(fā)表序列設(shè)計(jì)引物，采用分段PCR的方法獲得該病毒的兩個(gè)基因片段，并克隆到PMDT18載體，分別命名為PMDCPV2132和PMDCPV2925，連接這兩個(gè)DNA片段構(gòu)建包含幾乎全長(zhǎng)基因組的克隆，命名為PMDCPV4623，進(jìn)行序列測(cè)定?；蚪M序列分析顯示該分離株B2004與GENBANK發(fā)表序列的核苷酸序列相似性大于993％，與歐洲新西蘭的分離株遺傳關(guān)系最近；分析NS1及VP1的DNA核苷酸序列和蛋白氨基酸序列顯示了相同的特點(diǎn)而且與編碼非結(jié)構(gòu)蛋白讀碼框的核苷酸序列相比，編碼結(jié)構(gòu)蛋白的讀碼框核苷酸序列變異較大。與CPVD和CPVB1979完全基因組序列比對(duì)，除了在編碼區(qū)特別是結(jié)構(gòu)蛋白存在一些變異外，3′端非編碼區(qū)在266位缺失了AACC四個(gè)堿基；5′端非編碼區(qū)45544616位與全長(zhǎng)的基因組CPVD相對(duì)應(yīng)缺失了62BP的重復(fù)序列，47654890丟失了125BP的重復(fù)序列，即兩個(gè)62BP的重復(fù)序列。根據(jù)VP2的氨基酸序列分析，與已有的標(biāo)準(zhǔn)CPV基因型比較發(fā)現(xiàn)，該毒株426位氨基酸為ASN，555位氨基酸殘基為VAL，為目前流行的CPV2A型分析VP2的核苷酸序列和氨基酸序列同樣得出，CPVB2004與臺(tái)灣和歐洲的CPV2A遺傳關(guān)系較近，屬于同一個(gè)分枝。為了研究該病毒結(jié)構(gòu)蛋白的細(xì)胞定位，構(gòu)建了表達(dá)VPLN端區(qū)和VP2基因的真核表達(dá)質(zhì)粒PEGFPVP1和PEGFPVP2，轉(zhuǎn)染細(xì)胞48H后激光共聚焦顯微鏡LSM510，ZEISS下觀察GFP的表達(dá)，了解病毒衣殼蛋白的核運(yùn)輸功能。轉(zhuǎn)染PEGFPC1載體的細(xì)胞，熒光表達(dá)量大，且僅存在于細(xì)胞質(zhì)；而轉(zhuǎn)染PEGFPVP1的細(xì)胞熒光表達(dá)主要集中于細(xì)胞核，也有部分顯示在細(xì)胞核的邊緣轉(zhuǎn)染PEGFPVP2的細(xì)胞熒光表達(dá)則在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中分散分布。這些結(jié)果表明重組了VPLN端11個(gè)氨基酸殘基MAPPAKRARRG的PEGFPVP1主要在細(xì)胞核產(chǎn)生熒光，這11個(gè)氨基酸是較強(qiáng)的核定位序列，能夠運(yùn)送錨釘?shù)鞍踪|(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)而證明了VP1N端單一區(qū)的核定位功能。而攜帶了GFP的VP2沒(méi)有足夠強(qiáng)的核運(yùn)輸功能，把GFP全部運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核。為了進(jìn)一步了解CPV的生物學(xué)特點(diǎn)，觀察了CPV的感染過(guò)程，激光共聚焦顯微鏡下觀察病毒接種細(xì)胞后448H的CPV病毒粒子的亞細(xì)胞定位，病毒在接種細(xì)胞8H內(nèi)位于細(xì)胞質(zhì)；812H進(jìn)入細(xì)胞核，開始復(fù)制，約16H在細(xì)胞核內(nèi)積累大量病毒粒子，24H后出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)，3248H充滿于整個(gè)細(xì)胞。通過(guò)激光共聚焦研究轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和CPV進(jìn)入的關(guān)系表明，CPV與轉(zhuǎn)鐵蛋白使用相同的受體進(jìn)入細(xì)胞，并且在進(jìn)入后2H共定位于細(xì)胞核周質(zhì)；制備不同組織的原代細(xì)胞，接種CPV和TF孵育發(fā)現(xiàn)，TFR是CPV病毒組織特異性的原因，但也有其它因素影響CPV在不同組織細(xì)胞的復(fù)制。根據(jù)獲得序列設(shè)計(jì)4對(duì)SIRNA寡聚核苷酸，構(gòu)建PSISTRIKE系列的U6發(fā)卡結(jié)構(gòu)載體，研究質(zhì)粒介導(dǎo)的SIRNA對(duì)CPV病毒復(fù)制的影響。結(jié)果顯示，分別以CPV的核衣殼蛋白基因和非結(jié)構(gòu)蛋白基因?yàn)榘谢?，選擇的4段21NT的保守序列，構(gòu)建了小發(fā)夾RNASHTHAIRPINRNA，SHRNA的PSISTRIKE表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染FK81細(xì)胞篩選穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，通過(guò)病毒感染檢測(cè)、細(xì)胞活度測(cè)定和TCID測(cè)定，發(fā)現(xiàn)該種方法介導(dǎo)的SHRNA表達(dá)質(zhì)粒能抑制CPV病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和感染，具有抗病毒作用，但不能完全阻斷病毒的感染。第二部分狂犬病是由狂犬病毒引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的人獸共患傳染病，一旦發(fā)病無(wú)法救治，100％死亡。狗是最主要的宿主，而且也是感染人與其它動(dòng)物的主要傳播媒介；目前尚無(wú)有效的治療方法，疫苗接種是預(yù)防狂犬病的唯一有效途徑。家養(yǎng)和野生動(dòng)物接種疫苗并保持較高的抗體水平是預(yù)防和控制狂犬病的最有效途徑，因而對(duì)家養(yǎng)和野生動(dòng)物狂犬病免疫后中和抗體效價(jià)的監(jiān)測(cè)就顯得尤為重要。以本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建和保存的質(zhì)粒PGEMTNPCTN為基礎(chǔ)，將N基因亞克隆到表達(dá)載體PMALC2X中，構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒PMALNP，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109細(xì)胞誘導(dǎo)其表達(dá)。WESTERN印跡和ELISA驗(yàn)證了表達(dá)純化的MBPNP融合蛋白的抗原性和免疫原性。利用此融合蛋白作為包被抗原，構(gòu)建了一個(gè)檢測(cè)血清中抗狂犬病抗體水平的間接ELISA檢測(cè)體系，通過(guò)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)陰性血清、陽(yáng)性血清和采自免疫接種過(guò)狂犬病疫苗的犬科動(dòng)物的抗體水平，表明該EIJSA方法敏感性高，特異性好。測(cè)定樣品ELISA的OD值與標(biāo)準(zhǔn)方法RFFIT。測(cè)得的中和抗體滴度兩者具有很高的相關(guān)性R09436。安全方便的重組MBPNP融合蛋白能夠用于檢測(cè)犬科動(dòng)物的抗狂犬病抗體水平和免疫原。

簡(jiǎn)介：鷹嘴豆（CICERΑRIETINUML）屬野豌豆族（VICIEΑE）鷹嘴豆屬（CICER），又叫做桃豆、雞豌豆、羊頭豆、腦豆子、諾胡提（維語(yǔ)），在我國(guó)新疆已有2500年的種植歷史。其籽粒營(yíng)養(yǎng)成分全，含量高，營(yíng)養(yǎng)豐富，是一種重要的糧食來(lái)源，并具有一定的藥用價(jià)值。Α淀粉酶抑制劑在植物中普遍存在，由于其對(duì)Α淀粉酶有很強(qiáng)的特異性抑制作用，在植物防止病蟲害侵害等方面具有重要作用。因此，對(duì)鷹嘴豆種子所含Α淀粉酶抑制劑進(jìn)行研究將具有一定重要意義。本論文分別從鷹嘴豆種子中Α淀粉酶抑制劑的提取和抑制活性測(cè)定、不同品種間的差異分析、分離純化、基因克隆、子葉和胚中的抑制活性的分析、生物學(xué)特性、酶學(xué)特性以及抗氧化特性方面進(jìn)行了研究。其主要結(jié)論如下一、以人的唾液Α淀粉酶HSA為示蹤檢測(cè)劑，以淀粉為底物，通過(guò)DNS法，對(duì)鷹嘴豆種子中的Α淀粉酶抑制劑的粗提取影響因素進(jìn)行了探討，結(jié)果表明以20MMOLL、PH80的TRISHCL緩沖液作提取液，料液比為15WN時(shí)，提取液抑制活力最大；70℃水浴5MIN時(shí)，提取液抑制活力保存最大。二、比較34個(gè)鷹嘴豆品種的Α淀粉酶抑制劑抑制活力的差異，結(jié)果表明KAUBLI品種種子蛋白質(zhì)含量與其Α淀粉酶抑制劑抑制活力呈極顯著（P＜001）正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)R0317，而淀粉含量與Α－淀粉酶抑制劑抑制活力呈顯著P＜005負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)R0281；DESIL品種的相關(guān)性分析表明種子蛋白質(zhì)含量與淀粉酶抑制劑抑制活力之間，以及淀粉含量與淀粉酶抑制劑抑制活力之間無(wú)明顯相關(guān)性P＞005。鷹嘴豆種子中?。矸勖敢种苿┮种苹盍υ诓煌贩N間差異達(dá)到極顯著水平P＜005，表明鷹嘴豆種子中Α淀粉酶抑制劑抑制活力在不同品種間存在顯著的基因型差異。KAUBLI和DESIL品種的?。矸勖敢种苿┮种苹盍ψ兎謩e為73～879和169～1184UG，變異系數(shù)分別為4780％和6536％。34個(gè)品種Α淀粉酶抑制劑的抑制活力呈偏態(tài)分布，抑制活力在200～600UG的品種數(shù)占總品種數(shù)的618％。采用系統(tǒng)聚類法，34個(gè)鷹嘴豆品種被聚為4大類群，其品種數(shù)分別為1、7、12、14。三、對(duì)鷹嘴豆種子蛋白質(zhì)樣Α－淀粉酶抑制劑進(jìn)行了分離純化和序列分析，結(jié)果表明粗提液的硫酸銨分級(jí)沉淀，Α－淀粉酶抑制劑主要存在于組分Ⅲ（60～80％）和Ⅳ80～100％中；Ⅲ和Ⅳ的合并液用于離子交換色譜，結(jié)果顯示有一個(gè)分離峰具有相對(duì)較高的抑制活性；具有活性的峰收集液用作反相色譜，7個(gè)峰被洗脫下來(lái)，其中峰5具最高的抑制活力741％；峰5的收集液經(jīng)真空冷凍干燥，得到的粉末再經(jīng)胰蛋白酶水解后，高效液相串聯(lián)質(zhì)譜UPLCMSMS檢測(cè)得到三個(gè)肽片段，分別為L(zhǎng)HQNIGSSSSPDIYNPQAGR（片段1，殘基數(shù)20）、YQQEGSEEEENEGGNIFSGFK（片段2，殘基數(shù)21）和FYLAGNHEQEFLR（片段3，殘基數(shù)13）。經(jīng)聯(lián)網(wǎng)進(jìn)行序列比對(duì)，三個(gè)片段的序列與與鷹嘴豆球蛋白Q9SMJ4序列相似性達(dá)到100％，因此我們純化獲得的Α－淀粉酶抑制劑可識(shí)別為鷹嘴豆球蛋白，其分子量為25947KDA，同時(shí)推測(cè)其可能為鷹嘴豆球蛋白Q9SMJ4的一個(gè)亞基；進(jìn)一步將其氨基酸序列與其它已知幾類Α淀粉酶抑制劑氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，相似性很低（0～26％），說(shuō)明我們純化獲得的?。矸勖敢种苿┰诎被嵝蛄猩喜煌谝阎摩。矸勖敢种苿╊愋?。四、根據(jù)部分氨基酸序列以及相似性很高的Q9SMJ4蛋白的基因序列設(shè)計(jì)引物，克隆出一球蛋白樣Α淀粉酶抑制劑候選基因，其F全長(zhǎng)1494BP，編碼497個(gè)氨基酸，與Q9SMJ4蛋白的相似性為88％。五、對(duì)鷹嘴豆種子子葉和胚分別進(jìn)行Α淀粉酶抑制劑的提取，并對(duì)提取液進(jìn)行了抑制活性檢測(cè)，結(jié)果表明對(duì)真菌（BΑCILLUSSUBTILIS）來(lái)源的Α淀粉酶，子葉和胚提取液均未檢測(cè)到抑制活性；對(duì)HSA和PPA，胚提取液抑制活力分別為469％和43％，子葉提取液對(duì)HSA的抑制活力為321％，而對(duì)PPA則沒(méi)有檢測(cè)到抑制活力；對(duì)從植物來(lái)源的Α淀粉酶PA，子葉提取液未檢測(cè)到抑制活力，而胚提取液則具有較好的抑制活力；而對(duì)細(xì)菌（ASPERGILLUSYZΑE）來(lái)源的Α淀粉酶子葉和胚提取液抑制活性大小相近。鷹嘴豆種子發(fā)芽1D后，子葉和胚提取液對(duì)細(xì)菌來(lái)源的Α淀粉酶抑制活性迅速降低，發(fā)芽4D后，子葉和胚提取液已經(jīng)檢測(cè)不到抑制活性；發(fā)芽1D后，胚提取液已檢測(cè)不到對(duì)HSA的抑制活性，而在子葉提取液中還有部分抑制活力，發(fā)芽5D后，在子葉中已檢測(cè)不到抑制活性；發(fā)芽1D后，無(wú)論子葉提取液還是胚提取液對(duì)PPA和PA都檢測(cè)不到抑制活力。開花后10D，鷹嘴豆種子子葉提取液和胚提取液開始檢測(cè)到對(duì)HSA和細(xì)菌來(lái)源的Α－淀粉酶的抑制活性，30D時(shí)達(dá)到最大；對(duì)PA，胚提取液抑制活性在30D時(shí)達(dá)到最大，而在子葉提取液中均未檢測(cè)到抑制活性。?。矸勖敢种苿┐痔嵋簩?duì)HSA和PA有抑制活性，分別為469％和466％；對(duì)真菌、細(xì)菌源Α淀粉酶和PPA有較低或幾乎沒(méi)有抑制活性。而純化后的蛋白質(zhì)樣Α淀粉酶抑制劑對(duì)HSA、PA和PPA都具有較高的抑制活性，分別為736％673％和803％；對(duì)真菌和細(xì)菌源?。矸勖竸t沒(méi)有檢測(cè)到或有較低的抑制活力。與粗提液相比，純化后的蛋白質(zhì)樣Α－淀粉酶抑制劑對(duì)HSA、PA和PPA的抑制活性都有所提高。六、對(duì)蛋白質(zhì)樣?。矸勖敢种苿┑牟糠置笇W(xué)特性的研究結(jié)果表明蛋白質(zhì)樣Α淀粉酶抑制劑對(duì)三種Α淀粉酶（HSAPPA和PA）的抑制作用的最適溫度在37～40℃之間，最適PH值為65時(shí)，對(duì)PPA和PA而言，抑制劑的抑制活性范圍為PH40～85，而對(duì)HSA而言，其抑制活性范圍為PH40～95抑制劑對(duì)三種Α淀粉酶的抑制活性隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，其中對(duì)HSA和PA的抑制活性在20MIN時(shí)達(dá)到最大，而對(duì)PPA的抑制活性則在30MIN時(shí)達(dá)到最大；在底物濃度為1％時(shí)，抑制劑對(duì)HSA和PPA的抑制活力最大，而對(duì)PA的抑制活性，則在15％時(shí)最大；抑制劑濃度在007～032MGML的范圍內(nèi)時(shí)，其對(duì)HSA、PPA和PA的抑制活性隨濃度增加而增加；抑制劑對(duì)HSA、PPA和PA最大半抑制濃度分別由線性關(guān)系式Y(jié)2037X4744R20944Y1334X3304R20932Y1866X2881R20991，求得ID5O856106MOLL489106MOLL和109105MOLL抑制劑與?。矸勖傅慕Y(jié)合和底物之間呈混合型非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，抑制常數(shù)KI分別1668105MOLL，1864105MOLL和3037105MOLLKSI分別為1427105MOLL1558105MOLL和1410105RNOLL。七、考察了從提取到硫酸銨分級(jí)沉淀、離子交換色譜和反相液相色譜三步純化步驟獲得的?。矸勖敢种苿┑纳锘钚浴＝Y(jié)果表明?。矸勖敢种苿┚哂幸欢ǖ那宄杂苫瓦€原能力；在一定的反應(yīng)體系中，抑制劑的清除自由基和還原能力不僅隨濃度（一定濃度范圍內(nèi)）增加而增加，也隨純度的增加而增強(qiáng)。

簡(jiǎn)介：華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文LRIG3對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系GL15生物學(xué)特性影響的分子生物學(xué)機(jī)制研究姓名席桂發(fā)申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別博士專業(yè)外科學(xué)（神經(jīng)外科）指導(dǎo)教師雷霆20070501華華中中科科技技大大學(xué)學(xué)博博士士學(xué)學(xué)位位論論文物學(xué)特性的影響。方法方法甲基四唑蘭MTT和TRANSWELL分別檢測(cè)表皮生長(zhǎng)因子EGFAG1478對(duì)GL15細(xì)胞增殖和侵襲力的影響，逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)RTPCR和WESTERNBLOT分別檢測(cè)EGF和AG1478作用后GL15細(xì)胞膠質(zhì)纖維酸性蛋白GFAPMRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果結(jié)果外源性的EGF雙向調(diào)節(jié)GL15細(xì)胞增生和生長(zhǎng)，小劑量（50NGML，100NGML）EGF能促進(jìn)細(xì)胞增生和提高細(xì)胞侵襲能力以及GFAMINRNA和蛋白表達(dá)，而大劑量（200NGML）則能降低其增殖和侵襲能力，AG1478則能明顯拮抗EGFR活性。結(jié)論結(jié)論GL15膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系的生物學(xué)特性與EGFR所在的7號(hào)染色體過(guò)度擴(kuò)增密切相關(guān)。EGF可雙向調(diào)節(jié)GL15細(xì)胞系的生長(zhǎng)，AG1478能不完全抑制EGFR的活性。EGFR是基因治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的理想靶點(diǎn)。關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞表皮生長(zhǎng)因子受體；GL15細(xì)胞；膠質(zhì)母細(xì)胞瘤；膠質(zhì)纖維酸性蛋白第三部分第三部分LRIG3調(diào)控調(diào)控GL15細(xì)胞生物學(xué)活性的分子機(jī)制的研究細(xì)胞生物學(xué)活性的分子機(jī)制的研究目的目的探討LRIG3調(diào)控膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系GL15生物學(xué)行為的分子機(jī)制。方法方法用LRIG3EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染GL15細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期的變化，MTT法和TRANSWELL分析檢測(cè)EGF和AG1478對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞增殖和侵襲的影響，逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)RTPCR和WESTERNBLOT分別檢測(cè)EGF作用于轉(zhuǎn)染后的GL15細(xì)胞EGFR和LRIG3蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果結(jié)果將質(zhì)粒LRIG3EGFP轉(zhuǎn)染GL15細(xì)胞后，LRIG3主要在胞漿表達(dá)，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞其細(xì)胞周期多阻滯在S期，細(xì)胞侵襲性明顯下降。用100NGMLEGF分別作用于各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞后，不同的時(shí)間點(diǎn)其EGFR和LRIG3表達(dá)不同，隨時(shí)間延長(zhǎng)，EGFR的表達(dá)下降，LRIG3表達(dá)增加。結(jié)論結(jié)論過(guò)表達(dá)LRIG3EGFP可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)并使其侵襲性下降，這種抑制作用與EGFR的活性密切相關(guān)。LRIG3可能是基因治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤重要的靶基因。關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞LRIG3；表皮生長(zhǎng)因子；GL15細(xì)胞；膠質(zhì)母細(xì)胞瘤4

簡(jiǎn)介：第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文異黃酮改構(gòu)化合物對(duì)子宮內(nèi)膜組織的生物學(xué)效應(yīng)研究姓名陳誠(chéng)申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)婦產(chǎn)科學(xué)指導(dǎo)教師常青20070501

簡(jiǎn)介：噬肺軍團(tuán)菌LEGIONELLAPNEUMOPHILA在感染宿豐細(xì)胞過(guò)程中，能夠干擾宿主細(xì)胞的膜泡運(yùn)輸體系，募集包括源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的光滑膜泡、線粒體和核糖體等細(xì)胞器，并逃避吞噬泡的成熟過(guò)程，避免與溶酶體的融合降解，隨后在經(jīng)過(guò)修飾的吞噬泡內(nèi)復(fù)制增殖并裂解宿主細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生。噬肺軍團(tuán)菌的DOTICM四型分泌系統(tǒng)對(duì)于其對(duì)宿豐細(xì)胞內(nèi)的感染非常重要，該四型分泌系統(tǒng)突變的噬肺軍團(tuán)菌進(jìn)入宿主細(xì)胞后所形成的吞噬泡很快經(jīng)內(nèi)體成熟途徑與溶酶體融合而被降解。DOTICM系統(tǒng)可以分泌許多細(xì)菌效應(yīng)蛋白進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)，但是目前對(duì)這些效應(yīng)蛋白還知之甚少。本課題通過(guò)對(duì)噬肺軍團(tuán)菌基因組數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)噬肺軍團(tuán)菌基因組編碼的3個(gè)蛋白LPG2830、LPG2144和LPG0171分別含有真核細(xì)胞所特有的UBOXLPG2830和FBOXLPG2144和LPG0171結(jié)構(gòu)域，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域均廣泛存在于真核細(xì)胞的泛素系統(tǒng)中，能夠單獨(dú)或與其它細(xì)胞成分形成復(fù)合物催化泛素修飾反應(yīng)。在此，通過(guò)實(shí)驗(yàn)我們驗(yàn)證了LPG2830在體內(nèi)體外均擁有泛素連接酶的活性，可以利用UBCH5進(jìn)行自泛素化修飾，LPG2144與LPG0L7L均能夠形成SCF復(fù)合物，SCF復(fù)合物在真核細(xì)胞中能夠?qū)⒌孜锓核鼗揎棽⒈坏鞍酌阁w識(shí)別降解。LPG2830、LPG2144與LPG0171均能夠通過(guò)四型分泌系統(tǒng)進(jìn)入宿主細(xì)胞，它們通過(guò)各自C端的不同定位信號(hào)定位于特定的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，在COS7細(xì)胞中LPG2830與LPG0171定位于核周內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)，而LPG2144則定位于細(xì)胞質(zhì)膜上，盡管分別缺失這三個(gè)基因?qū)τ谑煞诬妶F(tuán)菌的胞內(nèi)生長(zhǎng)并沒(méi)有明顯影響，但是以上數(shù)據(jù)表明它們極可能通過(guò)干預(yù)或者模擬宿主細(xì)胞的泛素修飾體系來(lái)協(xié)助噬肺軍團(tuán)菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的生存與復(fù)制。

簡(jiǎn)介：銀屑病是一種以紅斑、鱗屑為主要表現(xiàn)的慢性炎癥性皮膚病，在我國(guó)和全世界都是常見(jiàn)病、多發(fā)病。當(dāng)前銀屑病的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全得以闡明，治療仍然存在療效不滿意和易于復(fù)發(fā)的問(wèn)題?，F(xiàn)代研究表明，銀屑病的基本病理表現(xiàn)為表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的過(guò)度增生和分化不全，以及真皮毛細(xì)血管的增生。我院內(nèi)制劑消銀解毒飲在我科臨床應(yīng)用二十余年，取得了良好的療效。我科近期完成國(guó)家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)科研課題臨床研究顯示，其治療銀屑病的總有效率為918％，顯著優(yōu)于復(fù)方青黛膠囊對(duì)照組；用藥治療4周后，患者鱗屑中IL8含量較治療前明顯下降。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，其對(duì)SEB誘導(dǎo)的小鼠血清IL8的升高有拮抗作用，具有顯著的免疫調(diào)節(jié)功能。為探討消銀解毒飲除通過(guò)免疫調(diào)節(jié)而發(fā)揮其治療作用外，是否尚具有對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的直接作用；對(duì)真皮血管內(nèi)皮細(xì)胞有何影響；以及消銀解毒飲中涼血、解毒、祛風(fēng)除濕等三組主要成分在治療銀屑病時(shí)所起的作用。我們運(yùn)用藥理血清的研究方法，以角質(zhì)形成細(xì)胞株COLO16和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304為研究對(duì)象，用四唑鹽MTT比色法觀察消銀解毒飲及拆方后各組藥物血清對(duì)其增殖的影響；用流式細(xì)胞技術(shù)觀察藥物對(duì)其凋亡的影響；用雙抗體夾心ABCELISA法測(cè)定藥物對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞分泌VEGF的影響。通過(guò)細(xì)胞生物學(xué)方面的研究，進(jìn)一步探討了消銀解毒飲治療銀屑病的作用機(jī)制和作用靶位。并為中醫(yī)辨證組方規(guī)律的研究以及銀屑病的臨床治療提供新的思路和方法。結(jié)果顯示①M(fèi)TX組較蒸餾水組細(xì)胞存活率明顯降低，隨著濃度的升高差異亦加大，在濃度高于10％時(shí)二者有極其顯著性差異P005。②在含藥血清濃度為20％時(shí)，解毒方組、祛風(fēng)除濕方組、涼血方組等三組細(xì)胞的凋亡率與蒸餾水組比較無(wú)顯著性差別P005；而消銀解毒飲組、MTX組凋亡率顯著增高，與蒸餾水組相比有極為顯著性差異P0001。③在5％濃度下，MTX組、消銀解毒飲組和涼血方組體外培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活率均有所降低，但只有MTX組與對(duì)照組比較有較為顯著的差別P005。在10％濃度下，消銀解毒飲組、涼血方組及MTX組血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活率均有所下降，其中消銀解毒飲組和MTX組細(xì)胞存活率下降的較為明顯，與對(duì)照組比較有極其顯著性差異P0001，涼血方組與對(duì)照組比較亦有較為顯著的差別P005。在20％濃度下，消銀解毒飲組、祛風(fēng)除濕方組、涼血方組以及MTX組血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活率均有下降，其中消銀解毒飲組、涼血方組及MTX組與對(duì)照組比較有極其顯著性差異P0001。祛風(fēng)除濕方組有較為顯著差異P005。④在5％濃度下，MTX組和消銀解毒飲組對(duì)體外培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞COLO16分泌VEGF有抑制作用，消銀解毒飲組的抑制作用更為明顯，與對(duì)照組相比有極其顯著的差異。在10％濃度下，消銀解毒飲組、解毒方組及MTX組對(duì)COLO16細(xì)胞分泌VEGF均有抑制作用，其中消銀解毒飲組和解毒方組與對(duì)照組比較有極其顯著性差異消銀解毒飲組P0001，解毒方組P001。在20％濃度下，消銀解毒飲組、解毒方組、涼血方組以及MTX組對(duì)COLO16細(xì)胞分泌VEGF均有抑制作用，其中消銀解毒飲組、解毒方組及MTX組與對(duì)照組比較有極其顯著性差異P0001。消銀解毒飲組、解毒方組涼血方組及MTX組隨著含藥血清濃度的升高VEGF含量降低，兩者呈負(fù)相關(guān)。結(jié)果表明①消銀解毒飲能抑制銀屑病患者角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增殖并誘導(dǎo)其凋亡。②消銀解毒飲對(duì)患者血管內(nèi)皮細(xì)胞的過(guò)度增生亦具有的抑制作用。③消銀解毒飲還可抑制患者角質(zhì)形成細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子。④在消銀解毒飲的拆方中，涼血藥物對(duì)抑制細(xì)胞的過(guò)度增殖發(fā)揮主要作用，解毒藥物對(duì)抑制角質(zhì)形成細(xì)胞分泌VEGF起主要作用；而三組藥物的協(xié)同配合可使各種作用明顯加強(qiáng)，從而對(duì)銀屑病的有效治療發(fā)揮更好的作用。⑤消銀解毒飲除通過(guò)免疫調(diào)節(jié)而發(fā)揮其治療作用外，還可通過(guò)對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增殖的直接抑制及誘導(dǎo)其凋亡，抑制真皮微血管的異常增生而發(fā)揮治療作用。消銀解毒飲可通過(guò)多個(gè)環(huán)節(jié)，多個(gè)靶點(diǎn)對(duì)銀屑病發(fā)揮治療作用。為臨床運(yùn)用消銀解毒飲治療銀屑病提供了重要的理論依據(jù)。

簡(jiǎn)介：本課題中我們利用前期真核表達(dá)的具有生物活性的人ICOSIG融合蛋白和構(gòu)建的膜表達(dá)ICOS的CHO細(xì)胞株研究ICOS是否向樹突狀細(xì)胞傳遞逆向信號(hào)及該逆向信號(hào)是否可以引起DCS相應(yīng)功能的改變進(jìn)一步深入探討ICOSLICOS通路信號(hào)傳遞的本質(zhì)和內(nèi)在機(jī)制全面的了解ICOSICOSL配受體相互作用對(duì)機(jī)體免疫平衡調(diào)節(jié)的重要作用。研究?jī)?nèi)容第一部分主要研究前期構(gòu)建的人ICOSIG與小鼠骨髓來(lái)源的樹突狀細(xì)胞體外特異性的結(jié)合、驗(yàn)證其生物學(xué)活性、研究可溶性ICOSIG蛋白本身對(duì)DCS的是否具有毒性作用為后續(xù)研究ICOSIG與DCS表面ICOSL結(jié)合傳遞逆向信號(hào)的可行性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。第二部分主要研究ICOSIG結(jié)合小鼠骨髓體外誘導(dǎo)培養(yǎng)第5天不成熟DCS表面ICOSL后能否引起DCS相應(yīng)的功能變化。檢測(cè)指標(biāo)包括DCS表型分子的變化、DCS分泌細(xì)胞因子的變化、DCS吞噬功能改變、DCS抗原遞呈功能改變、DCS對(duì)同種異基因T細(xì)胞刺激增殖能力變化。另外還利用體外構(gòu)建的表達(dá)膜錨定ICOS的CHO細(xì)胞株模擬體內(nèi)細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用對(duì)可溶性ICOSIG蛋白的生物學(xué)功能進(jìn)行驗(yàn)證。第三部分由于研究發(fā)現(xiàn)針對(duì)共刺激分子另一家族成員PD1配體PDL2的抗體作用于成熟DCS可向DCS傳遞逆向信號(hào)誘導(dǎo)產(chǎn)生了一種兼俱較強(qiáng)抗原攝取和抗原遞呈功能并有成熟DCS表型的新的一類DCS細(xì)胞。我們也擬進(jìn)一步研究ICOSIG作用于成熟過(guò)程中和成熟后的DCS能否引起DCS的功能改變。第四部分由于體外研究缺少體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境因素相互作用的影響我們借鑒文獻(xiàn)建立皮膚過(guò)敏反應(yīng)的動(dòng)物模型在體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證體外觀察到的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象并進(jìn)行相關(guān)機(jī)制的探討。實(shí)驗(yàn)方法采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)ICOSIG與其配體的特異性結(jié)合、實(shí)驗(yàn)處理后各DCS或T細(xì)胞表面分子的變化、胞內(nèi)細(xì)胞因子變化、DCS的吞噬功能等；采用ELISA和實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR的方法檢測(cè)各種培養(yǎng)上清中和培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)的多種細(xì)胞因子、趨化因子、表面分子的表達(dá)變化；采用ANNEXINVPI復(fù)染檢測(cè)不同因素處理后細(xì)胞凋亡的變化；采用CCK8檢測(cè)可溶性蛋白對(duì)DCS細(xì)胞的毒性和促增殖作用；采用3HTDR摻入檢測(cè)DCS細(xì)胞抗原遞呈功能和刺激異基因T細(xì)胞增殖能力；采用WESTERNBLOT方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組表達(dá)P38總蛋白和磷酸化蛋白的表達(dá)情況；采用小鼠皮膚過(guò)敏反應(yīng)的模型體內(nèi)驗(yàn)證ICOSIG的生物學(xué)功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果第一部分研究結(jié)果表明體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的DCS表面有一定程度的ICOSL的表達(dá)且ICOSL的表達(dá)隨DCS細(xì)胞的成熟而逐漸下調(diào)。為了驗(yàn)證體外表達(dá)可溶性人ICOSIG與小鼠DCS特異性結(jié)合我們先將DCS用CD1632封閉然后與ICOSIG或人IGG共孵育再加入熒光標(biāo)記抗人IGG二抗可檢測(cè)到ICOSIG與DC的結(jié)合而對(duì)照IGG與DC無(wú)結(jié)合；為進(jìn)一步驗(yàn)證其結(jié)合的特異性我們用不同濃度的ICOSIG與PE標(biāo)記的抗鼠ICOSL抗體同時(shí)作用于DC結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗ICOSL抗體與DC結(jié)合受到不同程度的阻斷；如果先加入ICOSIG與DC共孵育則ICOSIG可完全阻斷抗鼠ICOSL抗體與DC的結(jié)合。同時(shí)借助于ANNEXINVPI染色和CCK8試劑盒我們也發(fā)現(xiàn)ICOSIG處理過(guò)程中DCS死亡或凋亡情況與對(duì)照組相比沒(méi)有明顯變化。同時(shí)人源ICOSIG可在體外抑制不同品系小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)更表明其具有生物學(xué)活性。第二部分我們首先用可溶性ICOS蛋白與骨髓單個(gè)核細(xì)胞來(lái)源DCS5天未成熟共孵育檢測(cè)培養(yǎng)上清細(xì)胞因子IL2、IL4、IL6、IL10、IL12、TNFΑ、IFNΓ、TGFΒ1表達(dá)。其中IL2、IL4低于試劑盒檢測(cè)下限ICOSIG不改變DCS分泌IL10、IL12、TNFΑ、IFNΓ、TGFΒ1細(xì)胞因子的表達(dá)變化；而DCS表達(dá)IL6水平隨融合蛋白ICOSIG濃度的增加而明顯上調(diào)。定量RTPCR表明各實(shí)驗(yàn)組DCS表達(dá)TGFΒ1PGE2CCL3CCL4和CCL19無(wú)明顯差異但I(xiàn)COSIG處理組IL10有部分升高。與此同時(shí)流式細(xì)胞儀檢測(cè)表明ICOS處理組DCS表達(dá)共刺激分子CD83、CD80、CD86和IAB表達(dá)均比對(duì)照組有相應(yīng)的提高而ICOSL低于對(duì)照。進(jìn)一步定量RTPCR檢測(cè)ICOSLMRNA水平結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照蛋白組ICOSL表達(dá)無(wú)明顯差異。第三部分研究表明PDL2的抗體可以向成熟DCS傳遞逆向信號(hào)而我們及其他研究者均發(fā)現(xiàn)DCS成熟過(guò)程當(dāng)中ICOSL的表達(dá)量逐漸下調(diào)。那么ICOS能否向成熟過(guò)程中和成熟后的DCS傳遞逆向信號(hào)調(diào)節(jié)DCS的功能狀態(tài)我們?cè)贗COSIG處理DCS的同時(shí)加入100NGMLLPS或者是在加入100NGMLLPS處理24H誘導(dǎo)DCS成熟后再用ICOSIG處理DC24H。結(jié)果LPS單獨(dú)處理組DC分泌各種細(xì)胞細(xì)胞因子除IL2、IL4均比無(wú)LPS處理組明顯升高其表面分子的表達(dá)也明顯增加高于未刺激不成熟DCS。與對(duì)照組IGG相比ICOSIG加LPS處理組DCS分泌TGFΒ1的表達(dá)明顯高于對(duì)照組IL10、IL12P40、IL12P70、TNFΑ、IFNΓ等均無(wú)明顯差別。ICOSIGLPS組DC細(xì)胞各表面分子的表達(dá)也低于或類似于對(duì)照組。第四部分為了進(jìn)一步在體內(nèi)確證ICOSIG引起的DCS功能變化我們采用皮膚過(guò)敏實(shí)驗(yàn)研究ICOSIG作用后的DCS調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能的變化。用ICOSIG處理DCS再用P815AB多肽和5ΜM破傷風(fēng)毒素TETANUSTOXINTT多肽沖擊后經(jīng)尾靜脈輸入不同分組小鼠。2周后誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)。結(jié)果表明1無(wú)處理和對(duì)照IGG1蛋白處理不成熟DCS體外經(jīng)P815AB和TT刺激后能引起輕度足墊皮膚過(guò)敏反應(yīng)；而經(jīng)過(guò)ICOSIG處理后DCS能夠誘發(fā)出明顯的過(guò)敏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)鼠左足重量明顯增加；2若ICOSIG處理DCS細(xì)胞前先用足量抗ICOSL抗體封閉則ICOSIG處理足墊過(guò)敏反應(yīng)程度顯著下調(diào)；3若在DCS與ICOSIG或IGG1孵育時(shí)加入抗IL6阻斷性抗體則ICOSIG處理也不能引起典型足墊過(guò)敏反應(yīng)。如在ICOSIG處理DCS的同時(shí)加入LPS刺激再進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)則各實(shí)驗(yàn)組DCS細(xì)胞均可誘發(fā)出明顯的過(guò)敏反應(yīng)但對(duì)照與實(shí)驗(yàn)組之間無(wú)明顯差異。抑制DCS中P38MAPK通路進(jìn)而抑制IL6的分泌后DCS誘導(dǎo)皮膚過(guò)敏反應(yīng)的能力下調(diào)。討論共刺激分子家族成員配受體之間存在正反向信號(hào)的現(xiàn)象比較普遍。我們?cè)诒菊n題中致力于研究ICOSICOSL通路是否同樣存在反向信號(hào)并對(duì)該信號(hào)的性質(zhì)作深入的探討。以往研究用計(jì)算機(jī)模擬的方式證明人和小鼠的ICOS結(jié)構(gòu)相似ICOS與配體ICOSL結(jié)合面關(guān)鍵氨基酸的序列也高度相似；我們的研究表明真核表達(dá)的人ICOSIG確實(shí)可以和小鼠DCS細(xì)胞表面ICOSL發(fā)生特異性結(jié)合并具有生物學(xué)活性。進(jìn)一步研究表明可溶性ICOSIG可以向不成熟DC傳遞逆向信號(hào)引起骨髓來(lái)源不成熟DCS特異性分泌IL6增加同時(shí)DCS表型分子CD83、CD80、CD86和IAB表達(dá)均高于相應(yīng)對(duì)照組。ICOS處理不成熟DCS后其吞噬和抗原遞呈功能均增強(qiáng)引起TH1細(xì)胞比例和功能增加可在體內(nèi)促進(jìn)DCS調(diào)節(jié)的細(xì)胞免疫。然而我們也發(fā)現(xiàn)如果在ICOSIG作用DCS過(guò)程中加入LPS或CPG誘導(dǎo)DCS成熟則DCS分泌TGFΒ1升高。由于LPS等因素刺激DCS成熟后DCS分泌大量的促炎細(xì)胞因子如IL6、IL12、TNFΑ、IL1Β等因此盡管ICOS可以引起TGFΒ1的部分增加但其抑制免疫反應(yīng)的功能作用有限在體外僅引起DCS部分功能的改變?cè)隗w內(nèi)則不能檢測(cè)到明顯的功能差異。然而也存在另外一種可能因?yàn)镮COS僅在DCS成熟過(guò)程中促進(jìn)其表達(dá)TGFΒ1而我們是在使用LPS和ICOSIG作用完畢后收集細(xì)胞輸注小鼠體內(nèi)此時(shí)細(xì)胞已基本處于成熟狀態(tài)不同實(shí)驗(yàn)處理引起的DCS功能差異己接近消失在這種情況下皮膚過(guò)敏反應(yīng)的模型可能并不能夠真實(shí)反應(yīng)DCS功能的改變可能需要更好的模型來(lái)檢測(cè)相關(guān)的功能變化。通過(guò)本課題的研究我們首次證明和其他部分共刺激分子一樣ICOSICOSL通路也存在反向信號(hào)；然而不同的是隨著環(huán)境因素的不同ICOS可以通過(guò)同樣的配體ICOSL傳遞不同的免疫信號(hào)向不成熟DCS傳遞免疫刺激信號(hào)誘導(dǎo)IL6產(chǎn)生增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)；向成熟過(guò)程中的DCS傳遞免疫抑制信號(hào)誘導(dǎo)TGFΒ1表達(dá)調(diào)節(jié)成熟過(guò)程中DCS細(xì)胞的功能狀態(tài)。以往研究表明同一個(gè)配體可以通過(guò)不同受體傳遞不同信號(hào)如PD1通過(guò)其配體PDL1和PDL2可傳遞不同的信號(hào)；不同的配體也可以經(jīng)過(guò)同一個(gè)受體傳遞不同的信號(hào)如CCL19和CCL21結(jié)合CCR7、CD28CTLA4結(jié)合CD80CD86然而像ICOSICOSL這種同一個(gè)配體通過(guò)同一個(gè)受體傳遞不同信號(hào)的方式卻是首次證實(shí)這也更表明免疫系統(tǒng)、免疫細(xì)胞之間相互影響、相互調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性。因此ICOS可以通過(guò)DCS表面的ICOSL向不同成熟狀態(tài)的DCS傳遞不同的信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)體在不同狀態(tài)下的免疫應(yīng)答這為進(jìn)一步闡明ICOSICOSL通路在機(jī)體免疫調(diào)控中的作用以及針對(duì)該通路的靶向免疫治療提供了新的思路。

簡(jiǎn)介：環(huán)孢菌素ACSA已作為免疫抑制劑廣泛應(yīng)用于器官移植時(shí)的抗排斥反應(yīng)，在抗真菌、抗寄生蟲、抗HIV、抗炎以及逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥等方面也有一定的作用。CSA免疫抑制活性的構(gòu)效關(guān)系研究表明其結(jié)構(gòu)中1位上的氨基酸MEBMT2S3R4R6E3羥基4甲基2甲氨基6辛烯酸對(duì)環(huán)孢菌素A的生物學(xué)活性起著重要的作用，也是環(huán)孢菌素A化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾的一個(gè)重要位點(diǎn)。本研究以MEBMT作為結(jié)構(gòu)修飾的位點(diǎn)，開展了以下工作1合成并分離純化了未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道的12個(gè)CSA衍生物。對(duì)專利文獻(xiàn)報(bào)道的合成方法進(jìn)行改良，提高了收率和簡(jiǎn)化了反應(yīng)步驟。2建立了以硅膠柱色譜、高速逆流色譜和高效液相色譜等現(xiàn)代分離技術(shù)為主的分離純化方法，對(duì)合成得到的化合物進(jìn)行了有效而快速的純化。通過(guò)質(zhì)譜、紅外光譜和核磁共振進(jìn)行了結(jié)構(gòu)確認(rèn)。3研究合成的化合物對(duì)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的抑制活性。結(jié)果表明合成的CSA衍生物對(duì)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的抑制活性均低于環(huán)孢菌素A。但這些基團(tuán)改變后的衍生物之間抑制活性有明顯的變化，初步討論了他們的構(gòu)效關(guān)系。4研究合成的化合物對(duì)真菌的生長(zhǎng)抑制活性。結(jié)果表明CSA衍生物的抗真菌譜窄，只對(duì)少數(shù)真菌有作用，有些化合物對(duì)某些特定菌有較強(qiáng)的抑制作用。

簡(jiǎn)介：上海交通大學(xué)博士學(xué)位論文新的腫瘤抗原線粒體蛋白12的生物學(xué)功能研究姓名金姝申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別博士專業(yè)免疫學(xué)指導(dǎo)教師葛海良20080501上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位論文對(duì)5FU誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和周期的影響。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果表明高表達(dá)TAMPL2能促進(jìn)S期DNA合成，明顯逆轉(zhuǎn)5一FU導(dǎo)致的G1．S期轉(zhuǎn)換點(diǎn)阻滯，并顯示SUBGL期細(xì)胞比例明顯減少。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示高表達(dá)TAMPL2的SMMC．7721．TAMPL2細(xì)胞能顯著抑制5FU誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。為了解TAMPL2抗凋亡的機(jī)制，進(jìn)一步分析了活性CASPASE蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明活性CASPASE3、8、9的表達(dá)隨著5FU誘導(dǎo)的凋亡比例的升高而增加，但與對(duì)照相比TAMPL2能降低三者的表達(dá)。酶活性檢測(cè)結(jié)果亦顯示5FU誘導(dǎo)SMMC．7721．TAMPL2細(xì)胞凋亡后，CASPASE3、8、9的活性顯著低于對(duì)照細(xì)胞。并且在5FU處理后TAMPL2高表達(dá)的細(xì)胞中抗凋亡蛋白BCL．2、BCL．XL的表達(dá)增加，而促凋亡蛋白BAX表達(dá)減少。采用ROS熒光探針DCF經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TAMPL2能顯著抑制ROS的生成，而ROS作為一種信號(hào)分子具有廣泛的功能，參與細(xì)胞增殖、凋亡，周期的調(diào)控。綜上所述，本課題研究結(jié)果表明高表達(dá)TAMPL2細(xì)胞1上調(diào)膜受體表達(dá)，如胰島素樣生長(zhǎng)因子受體，加速細(xì)胞S期DNA合成，促進(jìn)細(xì)胞增殖。2抑制CASPASE3、8、9的酶活性，減少活性CASPASE3、8、9的蛋白表達(dá)。3上調(diào)抗凋亡蛋白BCL．2、BCL．XL表達(dá)、下調(diào)促凋亡蛋白BAX表達(dá)。4抑制ROS生成。結(jié)果提示TAMPL2可通過(guò)抑制CASPASE活性和ROS生成以抵抗細(xì)胞凋亡，有助于細(xì)胞增殖。深入研究TAMPL2蛋白的生物學(xué)功能將為揭示腫瘤發(fā)生、發(fā)展機(jī)制和腫瘤防治開辟新的途徑。關(guān)鍵詞TAMPL2，逆轉(zhuǎn)錄病毒，移植瘤，凋亡，細(xì)胞周期，活性氧2

簡(jiǎn)介：第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文肝癌患者外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)及其生物學(xué)特性姓名左國(guó)華申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別博士專業(yè)外科學(xué)（普外）指導(dǎo)教師梁平20080501第三軍醫(yī)人學(xué)博十學(xué)何論文后，將微量肝癌HEPG2細(xì)胞與外周血單個(gè)核細(xì)胞懸液混勻，再通過(guò)免疫磁性細(xì)胞分離，行免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，檢測(cè)免疫磁珠的特異性和敏感性，并計(jì)算癌細(xì)胞的回收率。2采集肝癌患者56例、肝炎和肝硬化患者19例、繼發(fā)性肝癌患者11例血樣，及18個(gè)健康志愿者的血樣作為陰性對(duì)照。用FICOLL密度梯度離心與免疫磁珠技術(shù)首先對(duì)患者的外周血進(jìn)行癌細(xì)胞的富集，然后運(yùn)用FITCCK標(biāo)記富集的癌細(xì)胞，免疫細(xì)胞熒光技術(shù)對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞行形態(tài)學(xué)分析，并用巢式RTPCR技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)AFPMRNA和HTERTMRNA。3對(duì)8例富集分離出來(lái)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)測(cè)定生長(zhǎng)曲線和細(xì)胞倍增時(shí)間評(píng)估細(xì)胞生長(zhǎng)增殖能力，錨著獨(dú)立性試驗(yàn)了解克隆集落能力，掃描電鏡觀察細(xì)胞表面超微結(jié)構(gòu)，以及裸鼠移植及成瘤觀察等方法研究其細(xì)胞生物學(xué)特性。結(jié)果1包被HABL8的免疫磁珠能與HEPG2細(xì)胞敏感而特異地結(jié)合，當(dāng)單個(gè)核細(xì)胞與HEPG2細(xì)胞比為1106L時(shí)可檢測(cè)到癌細(xì)胞，結(jié)合免疫細(xì)胞化學(xué)方法可檢出外周血單個(gè)核細(xì)胞中572％的微量癌細(xì)胞，無(wú)假陽(yáng)性。2在用肝癌HEPG2細(xì)胞所做的2組預(yù)實(shí)驗(yàn)中，免疫磁珠聯(lián)用增強(qiáng)了巢式RTPCR的靈敏度、特異性，其靈敏度為5ML血中含有一個(gè)癌細(xì)胞。3在臨床樣品的實(shí)驗(yàn)中，免疫磁珠富集后，結(jié)合免疫細(xì)胞熒光方法觀察肝癌患者外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞，檢出陽(yáng)性率為429％24／56，并與腫瘤的TNM分期有關(guān)；檢出細(xì)胞的形態(tài)可分為四類中等細(xì)胞型、大細(xì)胞型、有核細(xì)胞碎片和無(wú)核細(xì)胞碎片。4肝癌患者外周血中AFPMRNA及HTERTMRNA的檢出陽(yáng)性率分別為554％、482％。AFPMRNA及HTERTMRNA的檢出率和TNM分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移臨床參數(shù)密切相關(guān)。當(dāng)肝癌直徑大于5CM、多結(jié)節(jié)、伴門靜脈癌栓，AFPMRNA及HTERTMRNA的檢出率均明顯提高PO05。679％的肝癌患者至少表達(dá)一種標(biāo)志物，357％的患者兩種標(biāo)志物均陽(yáng)性。AFPMRNA和HTERTMRNA的檢出呈『F相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0363P005。HTERTMRNA在AFPMRNA陽(yáng)性和陰性的肝癌患者檢出率分別為645％、28％P005。AFPMRNA在肝炎和肝硬化患者中檢出率為211％HCCVS肝炎和肝硬化，PO05，繼發(fā)性肝癌患者及健康成人均未檢出；HTERTMRNA在繼發(fā)性肝癌患者中檢出率為636％，而肝炎和肝硬化及健康成人中均未檢出。58例標(biāo)本中，其中7例培養(yǎng)未成功，僅有1例出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞增生，異型性明顯，命名為HCC一27，共傳代培養(yǎng)5代。免疫細(xì)胞化學(xué)染色證實(shí)為肝癌細(xì)胞，HCC一27細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖及獨(dú)立錨著生長(zhǎng)能力顯著低于HEPG2細(xì)胞PO05。兩只裸鼠經(jīng)脾內(nèi)接種培養(yǎng)腫瘤的細(xì)胞，其中一只裸鼠出現(xiàn)肝內(nèi)移植瘤生長(zhǎng)。結(jié)論1成功利用碳二亞胺耦聯(lián)法制備了一種抗人肝細(xì)胞癌免疫磁性微珠，制

簡(jiǎn)介：點(diǎn)擊查看更多CD86人-鼠嵌合抗體的構(gòu)建、表達(dá)及其生物學(xué)活性的初步研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡(jiǎn)介：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院碩士學(xué)位論文人胰腺癌細(xì)胞系中SP細(xì)胞的分選及生物學(xué)表型研究姓名楊塔娜申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)細(xì)胞生物學(xué)指導(dǎo)教師張偉黃常志20090501北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院碩士研究生學(xué)位論文英文摘要ABSTRACTOBJECTIVETOISOLATESIDEPOPULATIONSPCELLSFROMHUMANPANCREATICCARCINOMACELLLINESWL990ANDTOSTUDYTHEBIOLOGICALPHENOTYPECHARACTERISTICSOFTHECELLPOPULATIONMETHODSFLUORESCENCEACTIVATEDCELLSORTINGWASUSEDTOISOLATEANDCOLLECTSPCELLSFROMSWL990CELLLINE；DRUGCHEMOSENSITIVITYOFSPANDNONSPCELLSWASMEASUREDBYATPTUMORCHEMOSENSITIVITYASSAYATETCA；THECLONEFORMATIONRATEOFSPANDNONSPCELLSWASEVALUATEDBYLIMITEDDILUTIONMETHOD；THEINVASIVCNESSANDMIGRATIONEFFICIENCYOFSPANDNONSPCELLSWASASSESSEDBYTRANSWELLCHAMBERS；THECELLCYCLEANDCELLDIFFERENTIATIONWASANALYZEDBYFLOWCYTOMETRY；THETUMORIGENICITYOFTWOCELLSUBPOPULATIONSWASFINISHEDBYINOCULATIONINNOD／SCIDMICE；TOIDENTIFYWHETHERVERAPAMILCOULDREVERSECHEMORESISTANCEAMONGDIFFERENTDRUGSRESUL月STHEREARE392PERCENTOFSPCELLSINSWL990CELLLINEATPTCAINDICATEDTHATSPCELLSWEREMORERESISTANCETOCHEMOTHERAPEUTICDRUGSTHANNONSPCELLS儼O05；THECLONEFORMATIONEFFICIENCYOFSPCELLSWASSTRONGERTHANNONSPCELLS，1979％2812％AND625％1041％P004，RESPECTIVELY；THESIMILARCONCLUSIONWASDRAWNININVASIVENESSANDMIGRATIONASSAYP005；THEPERCENTAGEOFG0／G1PHASECELLSIS6341114％INSPCELLS，AND5846_088％INNONSPCELLSPO05；THECELLDIFFERENTIATIONSTUDYSHOWEDTHATSPANDNONSPCELLSCONTAIN102_004％AND006002％SPCELLS儼O05；THETUMORFORMATIONRATEOFSPANDNONSPCELLSINVIVOIS6667％AND1111％CONCLUSIONSPCELLSEXISTEDINHUMANPANCREATICCARCINOMACELLLINESWL990ISANENRICHEDSOURCEOFPANCREATICTUMORINITIATINGCELLSWITHSTEMCELLPROPERTIESVERAPAMILCANREVERSETHEDRUGRESISTANCEOFTHETWOCELLPOPULATIONS，ESPECIALLYINSPCELLSKEYWORDSSTEMCELLS，TUMORSTEMCELLS，SIDEPOPULATIONCELLS，F(xiàn)LUORESCENCEACTIVATEDCELLSORTING6

簡(jiǎn)介：研究生簽名軍耆導(dǎo)品簽虧夕多絲努◆日河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本論文是在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特別加以標(biāo)注等內(nèi)容外，文中不包含其他人已發(fā)表或撰寫的研究成果，指導(dǎo)教師對(duì)此進(jìn)行了審定。本論文由本人獨(dú)立撰寫，文責(zé)自負(fù)。研究生簽名導(dǎo)師簽月衫日1刪刪Y1920275目錄中文摘要1英文摘要4研究論文CYCLINDL、NFKBP65和PCATENIN在食管癌中表達(dá)及其生物學(xué)意義前言7日LJ舌”一”一”””””，材料與方法8結(jié)果11附圖15附表25討論30結(jié)論32參考文獻(xiàn)34綜述WNT通路及CYCLINDL與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展38個(gè)人簡(jiǎn)歷49

簡(jiǎn)介：目的對(duì)人APOM基因定點(diǎn)誘變，構(gòu)建APOM野生型和突變型原核、真核表達(dá)載體，并檢測(cè)其生物學(xué)功能。方法TRIZOL法抽提肝L02細(xì)胞總RNA，RTPCR擴(kuò)增APOM全長(zhǎng)基因，將基因片斷重組到PMD18T質(zhì)粒中構(gòu)建PMD18TAPOM重組質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌JM109后篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒酶切和測(cè)序鑒定。采用SITEDDIRECTEDMUTAGENESIS試劑盒對(duì)APOM基因進(jìn)行體外定點(diǎn)誘變，DNA測(cè)序鑒定定點(diǎn)誘變成功與否。用雙酶切方法分別將APOM野生型和突變型基因定向連接到原核表達(dá)載體PGEXKG和真核表達(dá)載體PEGFPN3中，構(gòu)建野生型和突變型原核表達(dá)質(zhì)粒PGEXKGAPOM和真核表達(dá)質(zhì)粒PEGFPN3APOM，分別轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌DH5Α內(nèi)，提取質(zhì)粒酶切鑒定和測(cè)序鑒定。將構(gòu)建的原核表達(dá)質(zhì)粒PGEXKGAPOM轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DE3BL21，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果顯示，野生型原核表達(dá)質(zhì)粒PGEXKGAPOM能高效表達(dá)APOM融合蛋白。將構(gòu)建的野生型和突變型真核表達(dá)質(zhì)粒PEGFPN3APOM瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入7402細(xì)胞中，利用WESTERNBLOT技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的7402細(xì)胞APOM蛋白表達(dá)水平，利用3H標(biāo)記的膽固醇體外利用實(shí)驗(yàn)、THP1細(xì)胞參與的膽固醇流出實(shí)驗(yàn)以及CUSO4參與抗氧化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)野生型和突變型APOM蛋白生物學(xué)功能間差異。結(jié)果成功克隆APOM全長(zhǎng)基因并構(gòu)建野生型和突變型APOM原核、真核表達(dá)載體。WESTERNBLOT結(jié)果顯示，野生型原核表達(dá)質(zhì)粒能高效表達(dá)APOM融合蛋白。轉(zhuǎn)染真核野生型APOM重組質(zhì)粒的7402細(xì)胞用WB檢測(cè)，APOM蛋白表達(dá)水平增強(qiáng)，而轉(zhuǎn)染空載體組、空脂質(zhì)體組、和突變型APOM真核表達(dá)質(zhì)粒組的APOM蛋白表達(dá)水平均較低。在THP1細(xì)胞參與的膽固醇流出實(shí)驗(yàn)中，與空載體組、空脂質(zhì)體組、和APOM突變載體組比較，野生型載體組具有明顯的促進(jìn)膽固醇從泡沫細(xì)胞中流出的作用，差異具有顯著性（P＜005）；APOM突變型載體組、空載體組和空脂質(zhì)體組之間，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞005）。在CUSO4參與的抗氧化實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果顯示，APOM野生型真核表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)的蛋白與APOM突變型真核表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)的蛋白相比，前者的抗氧化能力明顯的強(qiáng)于后者而突變型組，差異具有顯著性（P＜005）；APOM突變型重組質(zhì)粒、空載體組和空脂質(zhì)體組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞005）。結(jié)論通過(guò)RTPCR、定點(diǎn)誘變及基因重組技術(shù)成功構(gòu)建野生型和突變型重組表達(dá)質(zhì)粒。通過(guò)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，野生型原核表達(dá)質(zhì)粒能高效表達(dá)APOM融合蛋白。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染APOM野生型真核表達(dá)質(zhì)粒后的7402細(xì)胞可以有效地高表達(dá)APOM蛋白，而APOM突變型真核表達(dá)質(zhì)粒組的APOM蛋白表達(dá)水平均較低。在膽固醇流出和抗氧化實(shí)驗(yàn)中，野生型重組體組具有明顯的促進(jìn)膽固醇從由THP1細(xì)胞轉(zhuǎn)化的泡沫細(xì)胞中流出和抗氧化作用而APOM突變型重組體組的這些功能明顯減弱或喪失，為進(jìn)一步研究APOM在脂質(zhì)代謝、在CHD發(fā)生發(fā)展中的作用奠定了基礎(chǔ)。

簡(jiǎn)介：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人申明所呈交的學(xué)位論文是我本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過(guò)的研究成果，也不包含為獲得我?；蚱渌逃龣C(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過(guò)的材料，與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示謝意。申請(qǐng)學(xué)位論文與資料若有不實(shí)之處，本人承擔(dān)一切相關(guān)責(zé)任。論文作者簽名縫日期洲、￡T；口中國(guó)醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本人完全了解中國(guó)醫(yī)科大學(xué)有關(guān)保護(hù)知識(shí)產(chǎn)權(quán)的規(guī)定，即研究生在攻讀學(xué)位期間論文工作的知識(shí)產(chǎn)權(quán)單位屬中國(guó)醫(yī)科大學(xué)。本人保證畢業(yè)離校后，發(fā)表論文或使用論文工作成果時(shí)署名單位為中國(guó)醫(yī)科大學(xué)，且導(dǎo)師為通訊作者，通訊作者單位亦署名為中國(guó)醫(yī)科大學(xué)。學(xué)校有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。學(xué)?？梢怨紝W(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容保密內(nèi)容除外，以采用影印、縮印或其他手段保存論文。論文作者簽名指導(dǎo)教師簽名日期?翟塑二皇；中文論著摘要HPSH一05790真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其生物學(xué)效應(yīng)的初步觀察目的幽門螺桿菌HELICOBACTERPYLORI，HPYLORI是慢性胃炎和消化性潰瘍的重要病原菌，且與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)。現(xiàn)已有許多研究致力于探討HPYLORI致病相關(guān)的細(xì)菌、宿主和環(huán)境因素之間的交互作用。其中，鑒定病原菌的毒力株和毒力蛋白是微生物致病機(jī)理研究的基本策略。ENROTH等采用2DE和免疫印跡技術(shù)對(duì)來(lái)自胃炎、十二指腸潰瘍和胃癌患者的不同HPYLORI臨床分離株進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究，結(jié)果提示不同類型胃疾病的HPYLORI菌株蛋白質(zhì)組中存在疾病特異性蛋白。目前研究發(fā)現(xiàn)，與H．PYLORI菌株致病性有關(guān)的基因位點(diǎn)主要為細(xì)胞毒素相關(guān)基CAGA及空泡毒素相關(guān)基因VACA等。國(guó)外報(bào)道，感染CAGA陽(yáng)性或VACA多態(tài)性變異的H．PYLORI菌株可以提高胃癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。除了CAGA，VACA外，近年來(lái)有學(xué)者陸續(xù)報(bào)道一些功能未知或尚未鑒定的菌株特異性基因位點(diǎn)也可能與H．PYLORI相關(guān)性胃疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。前期，我室通過(guò)抑制消減雜交SSH和斑點(diǎn)雜交的方法建立胃癌相關(guān)幽門螺桿菌差異基因文庫(kù)，對(duì)差異基因進(jìn)行篩選挑出11個(gè)與胃癌相關(guān)的高拷貝基因序列，證實(shí)了其中HPSH05790在胃癌患者來(lái)源的菌株L301及淺表性胃炎患者來(lái)源的菌株B975的基因中存在拷貝差異。目前，該差異基因的具體功能尚不清楚。KEGGKYOTOENCYCLOPEDIAOFGENESANDGENOMES數(shù)據(jù)庫(kù)報(bào)道其蛋白結(jié)構(gòu)域中包含PEPTIDYL．PROLYLCIS．TRANSISOMERASE功能域，即肽基．脯氨酰．順?lè)串悩?gòu)酶PPIASE，其被證實(shí)在嗜肺軍團(tuán)菌中具有毒力因子特征。本研究通過(guò)構(gòu)建胃癌相關(guān)差異基因幽門螺桿菌HPSH05790真核表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染3種胃細(xì)胞系A(chǔ)GS、SGC7901、GES．1觀察重組蛋白對(duì)細(xì)胞的增殖效應(yīng)和