簡(jiǎn)介：結(jié)腸癌COLECTALCANCER，CRC是常見的消化道惡性腫瘤。在我國(guó)，隨著生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)腸癌的發(fā)病率也呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)。高脂肪、高蛋白和低膳食纖維的飲食習(xí)慣是結(jié)腸癌發(fā)病的危險(xiǎn)因素，飲食干預(yù)法是預(yù)防結(jié)腸癌發(fā)生的有效方法，研究發(fā)現(xiàn)飲食中降低飽和脂肪的攝入提高多不飽和脂肪酸POLYUNSATURATEDFATTYACIDS，PUFAS的比例，可以起到降低腫瘤發(fā)病的作用。因此，PUFAS對(duì)結(jié)腸癌的作用機(jī)制值得深入探討。本研究一方面從體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)角度探討PUFAS對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞LOVO和RKO的生長(zhǎng)抑制、線粒體損傷、脂肪酸代謝等方面的影響另一方面從體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)角度出發(fā)，通過研究膳食長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸對(duì)小鼠腸道生理環(huán)境的改善研究其對(duì)結(jié)腸癌的預(yù)防作用。體外部分以人結(jié)腸癌細(xì)胞LOVO和RKO作為研究對(duì)象，構(gòu)建了PUFAS對(duì)兩細(xì)胞的體外損傷模型，結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)用到的六種脂肪酸亞油酸LINOLEICACID，LA、亞麻酸ALPHALINOLENICACID，ALA、花生四烯酸（ARACHIDONICACID，AA）、二十碳五烯酸EICOSAPENTAENOICACID，EPA、二十二碳六烯酸DOCOSAHEXAENOICACID，DHA、Γ亞麻酸ΓLINOLENICACID，GLA濃度大于120ΜM均能顯著抑制LOVO和RKO細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)兩細(xì)胞凋亡，但對(duì)正常細(xì)胞HUVEC影響較小，且半分化細(xì)胞RKO對(duì)PUFAS的敏感性較未分化細(xì)胞LOVO大。根據(jù)MTT結(jié)果，為了保證脂肪酸處理作用合理高效，我們選擇ALA150ΜM、EPA150ΜM、DHA150ΜM、LA150ΜM、GLA300ΜM、AA150ΜM、5FU10ΜM處理LOVO細(xì)胞，以ALA140ΜM、EPA120ΜM、DHA120ΜM、LA（120ΜM）、GLA200ΜM、AA120ΜM、5FU04ΜM處理RKO，建立PUFAS損傷結(jié)腸癌細(xì)胞體外模型。以此濃度進(jìn)一步研究PUFAS對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞LOVO和RKO的線粒體損傷、脂肪酸代謝等方面的影響，發(fā)現(xiàn)存在如下效果1從線粒體損傷的角度探討PUFAS對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制機(jī)制。結(jié)果表明，N3ALA、EPA、DHA和N6LA、GLA、AA脂肪酸作用可致LOVO和RKO細(xì)胞內(nèi)活性氧ROS水平和細(xì)胞漿內(nèi)CA2水平上升，ATP含量下降，導(dǎo)致BCL2家族中BAXBCL2基因表達(dá)比上調(diào)。進(jìn)而引起線粒體膜出現(xiàn)小氣孔，線粒體膜電位下降，細(xì)胞色素C和AIF等蛋白釋放到胞質(zhì)中，最終激活CASPASE9和CASPASE3活性，引發(fā)CASPASE級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。多不飽和脂肪酸對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞線粒體有一定的損傷作用，通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)其走向死亡。2研究PUFAS在LOVO和RKO細(xì)胞內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化及其代謝產(chǎn)物對(duì)兩細(xì)胞的影響。油紅O染色實(shí)驗(yàn)表明外源性添加的PUFAS通過細(xì)胞膜以脂滴形式儲(chǔ)存于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。通過氣相色譜法分析PUFAS作用下結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸組成，發(fā)現(xiàn)PUFAS作用后改變了LOVO和RKO細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸組成，提高不飽和脂肪酸比例，且在兩細(xì)胞內(nèi)N3和N6PUFAS之間的轉(zhuǎn)化存在緊密聯(lián)系。此外，多不飽和脂肪酸可通過抑制結(jié)腸癌細(xì)胞COX2、MPGES、PGDS和ALOX5的表達(dá)，進(jìn)而降低脂肪酸代謝產(chǎn)物促炎因子PGE2和LTB4的分泌，促進(jìn)抗炎因子LXA4的分泌，使癌細(xì)胞趨于不利于其生長(zhǎng)的抗炎狀態(tài)。體內(nèi)部分以C57BL6小鼠為對(duì)象，通過分析富含長(zhǎng)鏈脂肪酸的魚油、亞麻籽油、葵花籽油對(duì)小鼠結(jié)腸菌群結(jié)構(gòu)，小鼠腸道主要代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸、膽汁酸，小鼠結(jié)腸組織脂類代謝參數(shù)的影響，分析多不飽和脂肪酸在改善腸道生理環(huán)境，預(yù)防結(jié)腸癌發(fā)生方面的功效。結(jié)果表明膳食長(zhǎng)鏈脂肪酸可激活脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因PPARΑ、OSTΑMRNA的表達(dá)促進(jìn)脂肪代謝，魚油和亞麻籽油能提高結(jié)腸組織中N3N6的比值，保護(hù)結(jié)腸組織免受氧化應(yīng)激損傷。此外，膳食長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸能改變小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)，魚油和亞麻籽油處理組在EUBACTERIUMNOVOSPHINGOBIUM，和HYMENOBACTER上的豐度高于對(duì)照組。富含N6PUFAS的葵花籽油組的結(jié)腸微生物多樣性不如富含N3PUFAS魚油組和亞麻籽油組。亞麻籽油、葵花籽油，特別是魚油中的多不飽和脂肪酸可促進(jìn)丁酸產(chǎn)生菌EUBACTERIUM的生長(zhǎng)，提高短鏈脂肪酸含量（特別是丁酸含量提高50％），降低腸道PH值，減少次級(jí)膽汁酸含量，起到改善腸道環(huán)境的作用，對(duì)結(jié)腸癌的發(fā)生有一定的預(yù)防作用。

簡(jiǎn)介：目的TBC1D3又稱PRC17（前列腺癌基因17），是人科特有的癌基因，高表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞，如前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌和骨髓增生異常綜合征等。TBC1D3的表達(dá)可使正常成纖維細(xì)胞NIH3T3發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化在裸鼠體內(nèi)形成腫瘤，亦可延遲EGFR和IRS1的降解來增強(qiáng)GFS信號(hào)，導(dǎo)致細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生。GFS信號(hào)負(fù)反饋調(diào)節(jié)TBC1D3的穩(wěn)定性，在E3泛素連接酶CUL7的介導(dǎo)下泛素化和降解TBC1D3，使得TBC1D3的蛋白水平維持動(dòng)態(tài)平衡。鈣調(diào)蛋白CAM參與眾多蛋白的穩(wěn)定性調(diào)節(jié)，如雌激素受體ΑERΑ和TRE17USP6等，我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示CAM通過抑制TBC1D3的降解提高其穩(wěn)定性。因此，探討CAM調(diào)節(jié)TBC1D3穩(wěn)定性的機(jī)制，將有助于闡明CAM和TBC1D3在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，為腫瘤的診斷和防治提供新線索。方法1為了研究CAM對(duì)TBC1D3降解的調(diào)節(jié)作用，我們轉(zhuǎn)染GSTCAM使CAM高表達(dá)或使用CAM抑制劑W7抑制內(nèi)源性CAM功能，通過WESTERNBLOT和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)分別觀察MCF7和BT549細(xì)胞內(nèi)CAM對(duì)TBC1D3降解和泛素化的調(diào)節(jié)作用。通過抽提細(xì)胞漿、細(xì)胞核蛋白，觀察TBC1D3降解的亞細(xì)胞部位及CAM的調(diào)節(jié)作用。2為了探討CAM抑制TBC1D3降解的機(jī)制是否通過相互作用，以GST載體為對(duì)照，將GSTCAM和FLAGTBC1D3復(fù)合轉(zhuǎn)染MCF7細(xì)胞，用抗GST抗體進(jìn)行免疫共沉淀，檢測(cè)CAM與TBC1D3之間的相互作用以FLAG載體為對(duì)照，將FLAGTBC1D3和GSTCAM復(fù)合轉(zhuǎn)染MCF7細(xì)胞，用抗FLAG抗體進(jìn)行免疫共沉淀，反向檢測(cè)TBC1D3與CAM之間的相互作用使用CA2螯合劑EGTA處理，通過免疫共沉淀分別觀察MCF7和BT549細(xì)胞內(nèi)CAM與TBC1D3的相互作用OVERLAPPCR構(gòu)建TBC1D3內(nèi)在缺失突變體FLAGTBC1D3△157171和FLAGTBC1D3△303312，以FLAG為對(duì)照，分別將GSTCAM和FLAGTBC1D3及其突變體復(fù)合轉(zhuǎn)染MCF7細(xì)胞，抗FLAG抗體做免疫共沉淀檢測(cè)它們與CAM的相互作用，以分析確定TBC1D3氨基酸序列中與CAM相互作用的功能部位以GST載體為對(duì)照，F(xiàn)LAGTBC1D3及其突變體與GSTCAM分別復(fù)合轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染MCF7細(xì)胞，抗GST抗體做免疫共沉淀，反向驗(yàn)證TBC1D3氨基酸序列中與CAM相互作用的功能部位。3為了分析TBC1D3內(nèi)與CAM結(jié)合部位的功能，用OVERLAPPCR構(gòu)建TBC1D3內(nèi)點(diǎn)突變體FLAGTBC1D3Y163AT165A和FLAGTBC1D3K166R。分別轉(zhuǎn)染FLAGTBC1D3、FLAGTBC1D3△157171及點(diǎn)突變體，通過WESTERNBLOT和COIP檢測(cè)TBC1D3及點(diǎn)突變體的降解水平和泛素化水平以FLAG為對(duì)照，將FLAGTBC1D3及點(diǎn)突變體分別和GSTCAM復(fù)合轉(zhuǎn)染MCF7細(xì)胞，抗FLAG抗體做免疫共沉淀檢測(cè)它們與CAM的相互作用。4為了檢測(cè)TBC1D3的穩(wěn)定性對(duì)細(xì)胞遷移的作用，以FLAG空載體為對(duì)照，與FLAGTBC1D3分別轉(zhuǎn)染MCF7和BT549細(xì)胞，進(jìn)行劃痕和TRANSWELL遷移實(shí)驗(yàn)。為了探討TBC1D3影響細(xì)胞遷移的機(jī)制，F(xiàn)LAG空載體和FLAGTBC1D3分別轉(zhuǎn)染MCF7細(xì)胞，無血清饑餓24H后，明膠酶譜法檢測(cè)培養(yǎng)液內(nèi)MMP9活性實(shí)時(shí)熒光定量PCR和WESTERNBLOT分別檢測(cè)細(xì)胞裂解物內(nèi)MMP9的MRNA和蛋白水平。復(fù)合轉(zhuǎn)染GSTCAM，觀察CAM對(duì)TBC1D3穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)作用對(duì)細(xì)胞遷移、MMP9活性和蛋白水平的影響。結(jié)果1WESTERNBLOT結(jié)果表明10％FCS可誘導(dǎo)TBC1D3降解，復(fù)合轉(zhuǎn)染CAM并高表達(dá)時(shí)，10％FCS誘導(dǎo)的TBC1D3降解受到明顯抑制，說明CAM能夠抑制TBC1D3的降解使用W7抑制內(nèi)源性CAM功能后，TBC1D3的降解趨勢(shì)更加明顯，說明內(nèi)源性CAM在TBC1D3降解中的抑制作用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)顯示10％FCS可有效誘導(dǎo)TBC1D3的泛素化，CAM的表達(dá)可大大降低TBC1D3的泛素化水平，說明CAM可以降低TBC1D3的泛素化水平細(xì)胞漿、細(xì)胞核蛋白抽提實(shí)驗(yàn)顯示在MCF7細(xì)胞中，10％FCS刺激誘導(dǎo)TBC1D3降解既發(fā)生于細(xì)胞漿、也發(fā)生于細(xì)胞核且細(xì)胞核內(nèi)降解趨勢(shì)更加明顯復(fù)合轉(zhuǎn)染CAM并高表達(dá)時(shí)，TBC1D3細(xì)胞漿、細(xì)胞核內(nèi)降解受到明顯的抑制，均大大減少。在BT549細(xì)胞中，10％FCS刺激誘導(dǎo)的TBC1D3降解在細(xì)胞漿、細(xì)胞核內(nèi)均被檢測(cè)到且細(xì)胞漿內(nèi)降解趨勢(shì)更加明顯復(fù)合轉(zhuǎn)染CAM并高表達(dá)時(shí)，TBC1D3細(xì)胞漿、細(xì)胞核內(nèi)降解均受到明顯的抑制。2用抗GST抗體進(jìn)行免疫共沉淀，GST對(duì)照組無TBC1D3結(jié)合條帶，GSTCAM組檢測(cè)到TBC1D3結(jié)合條帶，說明TBC1D3與CAM存在相互作用以抗FLAG抗體做反向免疫共沉淀，F(xiàn)LAG對(duì)照組無CAM結(jié)合條帶，F(xiàn)LAGTBC1D3組檢測(cè)到CAM結(jié)合條帶，說明CAM與TBC1D3存在相互作用使用EGTA螯合CA2后，以抗FLAG抗體或抗GST抗體做免疫共沉淀，均未檢測(cè)到TBC1D3與CAM的相互作用，提示CAM與TBC1D3的相互作用依賴于CA2環(huán)境。OVERLAPPCR構(gòu)建的TBC1D3缺失突變體FLAGTBC1D3△157171和FLAGTBC1D3△303312，經(jīng)BAMHⅠ和XHOⅠ雙酶切和測(cè)序鑒定，序列正確符合預(yù)期。以抗FLAG抗體或抗GST抗體做免疫共沉淀，結(jié)果均顯示157位171位氨基酸缺失后TBC1D3不能與CAM結(jié)合，提示TBC1D3蛋白序列上與CAM相互作用的部位可能在N端的157到171位氨基酸之間。3OVERLAPPCR構(gòu)建的TBC1D3點(diǎn)突變體FLAGTBC1D3Y163AT165A和FLAGTBC1D3K166R，經(jīng)BAMHⅠ和XHOⅠ雙酶切和測(cè)序鑒定，序列正確符合預(yù)期。WESTERNBLOT結(jié)果顯示10％FCS可誘導(dǎo)FLAGTBC1D3Y163AT165A降解，而FLAGTBC1D3△157171和FLAGTBC1D3K166R無明顯降解以抗FLAG抗體做免疫共沉淀檢測(cè)泛素水平，結(jié)果顯示FLAGTBC1D3Y163AT165A與FLAGTBC1D3均檢測(cè)到明顯泛素化，F(xiàn)LAGTBC1D3K166R泛素水平大大降低。以抗FLAG抗體做免疫共沉淀，結(jié)果顯示TBC1D3和TBC1D3K166R與CAM存在相互作用，F(xiàn)LAG對(duì)照和TBC1D3Y163AT165A無CAM結(jié)合條帶，提示CAM抑制TBC1D3的降解是通過與TBC1D3相互作用抑制K166的泛素化。4細(xì)胞劃痕和TRANSWELL遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染FLAGTBC1D3的MCF7和BT549細(xì)胞遷移能力明顯強(qiáng)于轉(zhuǎn)染FLAG空載體實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示TBC1D3可上調(diào)MMP9MRNA水平，WESTERNBLOT檢測(cè)顯示TBC1D3可上調(diào)MMP9蛋白水平，明膠酶譜實(shí)驗(yàn)顯示TBC1D3可增強(qiáng)MMP9活性，提示TBC1D3促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移可能是通過上調(diào)MMP9的蛋白和活性水平。復(fù)合轉(zhuǎn)染CAM時(shí)，TBC1D3上調(diào)的MMP9的蛋白和活性水平以及誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移均被增強(qiáng)。結(jié)論1CAM增強(qiáng)人乳腺癌細(xì)胞漿、細(xì)胞核TBC1D3蛋白的穩(wěn)定性。2CA2CAM與TBC1D3的N端157位171位氨基酸序列相互作用。3泛素化位點(diǎn)K166突變?cè)鰪?qiáng)人乳腺癌細(xì)胞內(nèi)TBC1D3蛋白的穩(wěn)定性。4CAM增強(qiáng)TBC1D3誘導(dǎo)的人乳腺癌細(xì)胞MMP9活性和細(xì)胞遷移。

簡(jiǎn)介：四川大學(xué)博士學(xué)位論文法醫(yī)昆蟲種屬鑒定的分子生物學(xué)方法研究姓名應(yīng)斌武申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別博士專業(yè)法醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師侯一平20050508四川入學(xué)博士學(xué)位論文應(yīng)斌武蟲的該基因測(cè)序結(jié)果。通過分子進(jìn)化關(guān)系分析，我們得到了他們之間的親緣關(guān)系圖。對(duì)于微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記，我們發(fā)現(xiàn)了具有舍蠅種屬特異的微衛(wèi)星，并通過分子進(jìn)化關(guān)系分析了三個(gè)地區(qū)舍蠅的近緣關(guān)系。結(jié)論基于不同的遺傳標(biāo)記，我們建立了兩種用于法醫(yī)昆蟲學(xué)種屬鑒定的體系。比較了兩種遺傳標(biāo)記對(duì)法醫(yī)常見嗜尸性蒼蠅種屬鑒定的特點(diǎn)，提示兩種遺傳標(biāo)記可以用于法醫(yī)常見昆蟲的種屬鑒定，為法醫(yī)鑒別嗜尸性蠅類種屑的提供了可供選擇的新方法?！娟P(guān)鍵詞】法醫(yī)昆蟲學(xué)，DNA分型，微衛(wèi)星，線粒體DNA，嗜尸性蒼蠅。種屬鑒定2

簡(jiǎn)介：微博、微信所代表的新型媒體發(fā)展迅速，在給人們的生活帶來極大的影響同時(shí)也給教育領(lǐng)域帶來了挑戰(zhàn)和變革。微視頻在教學(xué)中的的應(yīng)用，已經(jīng)成為教育技術(shù)研究的熱點(diǎn)和前沿。筆者希望能借助微視頻來解決生物學(xué)教學(xué)中存在的問題，如課堂枯燥乏味、課時(shí)較少、實(shí)驗(yàn)教學(xué)無法實(shí)施等。如何運(yùn)用微視頻激發(fā)學(xué)生的興趣，以降低認(rèn)知負(fù)荷，如何提高學(xué)習(xí)效率和發(fā)揮微視頻的教學(xué)優(yōu)勢(shì)是重點(diǎn)關(guān)注的問題。本論文研究的主要問題為什么樣的微視頻能夠有效促進(jìn)高中生物學(xué)課堂教學(xué)；如何利用生物學(xué)微視頻才能做到科學(xué)、合理、有效；微視頻可以解決生物學(xué)教學(xué)中存在的哪些問題；在高中生物學(xué)課堂教學(xué)中實(shí)際應(yīng)用微視頻會(huì)達(dá)到什么樣的效果。筆者從高中生物學(xué)的教學(xué)實(shí)際出發(fā)，以穩(wěn)態(tài)與環(huán)境一書為例，在分析生物學(xué)教學(xué)內(nèi)容、教學(xué)方法和課堂教學(xué)中存在問題的基礎(chǔ)上，探討微視頻應(yīng)用于高中生物學(xué)課堂的可能性、應(yīng)用模式及應(yīng)用效果。教學(xué)實(shí)踐的對(duì)象為聊城市第三中學(xué)高二（20）班全體學(xué)生，設(shè)計(jì)了學(xué)生調(diào)查問卷來收集信息，并且分別對(duì)學(xué)生、教師進(jìn)行了訪談，以獲取最真實(shí)有效的研究資料。研究表明，微視頻在生物學(xué)課堂教學(xué)中的應(yīng)用，確實(shí)激發(fā)了學(xué)生高漲的學(xué)習(xí)熱情，其教學(xué)內(nèi)容的呈現(xiàn)方式，有利于學(xué)生掌握知識(shí)的重點(diǎn)和難點(diǎn)，有效提高了課堂教學(xué)的效率。但微視頻教學(xué)必須建立在傳統(tǒng)教學(xué)模式的基礎(chǔ)上，微視頻的制作需要一定的軟件應(yīng)用能力，在課堂中使用需要多媒體設(shè)備，而且并不是所有的生物學(xué)知識(shí)都適合用微視頻來呈現(xiàn)，因此在實(shí)際應(yīng)用中存在一些局限。微視頻制作必須根據(jù)教學(xué)內(nèi)容和學(xué)生特點(diǎn)，注重微視頻教學(xué)與傳統(tǒng)教學(xué)方式的結(jié)合，使兩者能夠互為補(bǔ)充。在實(shí)際應(yīng)用過程中，教師要控制好一節(jié)課內(nèi)使用微視頻的數(shù)量、呈現(xiàn)方式及播放時(shí)間。教師還要注意設(shè)置恰當(dāng)?shù)膯栴}來引導(dǎo)學(xué)生觀看微視頻，以保證發(fā)揮微視頻的最佳教學(xué)效果。制作微視頻需要大量的時(shí)間和精力，由個(gè)人單獨(dú)實(shí)施存在一定的難度，最好以學(xué)科為單位由多位教師合作進(jìn)行，資源共享以提高工作效率。

簡(jiǎn)介：IIIIILIIIIIIIIIIIIIIIY3393831密級(jí)論文編號(hào)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院學(xué)位論文鴨疫里默氏桿菌生物素合成相關(guān)基因BIOF生物學(xué)特性分析及應(yīng)用BIOLOGICALCHARACTERIZATIONOFBIOTINSYNTHESISASSOCIATEDBIOFGENEINRIEMERELLAANATIPESTIFERANDITSAPPLICATION碩士研究生任曉梅指導(dǎo)教師于圣青研究員申請(qǐng)學(xué)位類別農(nóng)學(xué)碩士專業(yè)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究方向動(dòng)物傳染病及其病原分子流行病學(xué)培養(yǎng)單位上海獸醫(yī)研究所研究生院2018年5月SECRECYNO。CHINESEACADEMYOFAGRICULTURALSCIENCESDISSERTATIONBIOLOGICALCHARACTERIZATIONOFBIOTINSYNTHESISASSOCIATEDBIOFGENEINRIEMERELLAANATIPESTIFERANDITSAPPLICATIONMSCANDIDATEXIAOMEIRENSUPERVISORPROFESSORSHENGQINGYUMAJORPREVENTIVEVETERINARYMEDICINESPECIALTYANIMALINFECTIOUSDISEASEANDPATHOGENICMOLECULAREPIDEMIOLOGYMAY2018

簡(jiǎn)介：萘降解菌株P(guān)SEUDOMONASPUTIDAND6分離自天津市南排污河是一株高效降解萘的菌株能在48H內(nèi)降解培養(yǎng)基中98％的萘2GL。同大部分萘降解細(xì)菌一樣PPUTIDAND6的萘降解基因位于一個(gè)101858BP的大質(zhì)粒PND61上此質(zhì)粒已被測(cè)序和注釋。序列分析表明PPUTIDAND6的萘降解基因排列及降解途徑都與其它經(jīng)典的萘降解菌株相似上游操縱子NAH操縱子包括NAHAAABACADBFCED編碼將萘轉(zhuǎn)變?yōu)樗畻钏崴璧拿赶掠尾倏v子SAL操縱子包括NAHGTHINLOMKJY編碼水楊酸經(jīng)由兒茶酚間位裂解途徑生成乙酰乙醛和丙酮酸所需的酶。PPUTIDAND6的獨(dú)特之處在于在經(jīng)典的萘降解操縱子之外有兩個(gè)額外的萘降解基因既水楊醛脫氫酶基因NAHF的同工基因NAHV和水楊酸羥化酶基因NAHG的同工基因NAHU。本論文主要研究了其中水楊醛脫氫酶同工酶NAHV的生物學(xué)功能和轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式。質(zhì)?？截悢?shù)PLASCOPYNUMBERPCN是指每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中所含質(zhì)粒的個(gè)數(shù)。PPUTIDAND6的萘降解基因位于大質(zhì)粒。PND61上。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCRQUANTITATIVEREALTIMEPCRQPCR方法測(cè)定了萘降解菌株P(guān)PUTIDAND6中萘降解質(zhì)粒PND61的拷貝數(shù)為2。通過自殺載體基因敲除的方法分別構(gòu)建了NAHF和NAHV基因突變株ND6△△F和ND6△△V。對(duì)比了野生型ND6與基因敲除菌株ND6△△F和ND6△△V在生長(zhǎng)和萘降解速率方面的不同發(fā)現(xiàn)不論ND6△△F還是ND6△△V的萘降解速率與野生型ND6相比都有所降低在MRNA和蛋白表達(dá)水平上在NAHF或NAHV基因突變株ND6△△F或ND6△△V中另一基因NAHV或NAHF的表達(dá)量都比野生型高在水楊醛脫氫酶活性方面無論以何種碳源培養(yǎng)野生型ND6的水楊醛脫氫酶活性都比基因突變株高。以上結(jié)果表明雖然NAHF的水楊醛脫氫酶活性比NAHV高但萘降解菌株P(guān)PUTIDAND6中額外的水楊醛脫氫酶NAHV的存在增加了細(xì)胞中水楊醛脫氫酶的劑量從而加快了萘降解的速率NAHV能作為經(jīng)典水楊醛脫氫酶NAHF的后備和補(bǔ)充當(dāng)經(jīng)典水楊醛脫氫酶基因NAHF在細(xì)菌的進(jìn)化過程中發(fā)生突變或缺失后NAHV能部分取代NAHF的作用行使水楊醛脫氫酶的功能使得突變株能繼續(xù)生存。構(gòu)建了NAHR基因突變株ND6△△R對(duì)比了突變株與野生株中NAHF和NAHV在MRNA及酶活性水平的差異。無論以何種碳源培養(yǎng)誘導(dǎo)物水楊酸鈉是否存在時(shí)PPUTIDAND6中的NAHR基因都有一定量的本底表達(dá)當(dāng)加入誘導(dǎo)物水楊酸鈉時(shí)NAHR基因的表達(dá)量增加PPUTIDAND6菌株中的水楊醛脫氫酶基因NAHF和NAHV都不是組成型表達(dá)以葡萄糖為唯一碳源時(shí)檢測(cè)不到它們的表達(dá)。只有當(dāng)誘導(dǎo)物水楊酸鈉和調(diào)節(jié)蛋白NAHR同時(shí)存在水楊酸鈉與NAHR相結(jié)合才能使RNA聚合酶I結(jié)合于啟動(dòng)子的正確位置起始水楊醛脫氫酶基因NAHF和NABY的轉(zhuǎn)錄。

簡(jiǎn)介：貝氏柯克斯體（COXIELLABURII，簡(jiǎn)稱CB）是一種革蘭氏陰性、專性胞內(nèi)寄生菌，是引起人類Q熱的病原體13。CB主要通過氣溶膠4、蜱蟲叮咬等途徑，在人與動(dòng)物之間進(jìn)行傳播，是已知的感染性最強(qiáng)的病原體之一，也是一種潛在的生物戰(zhàn)劑5和生物恐怖劑6。研究發(fā)現(xiàn)已知的CB分離株中均含有一種質(zhì)粒（QPH17、QPRS8、QPDG9、QPDV1011）或者整合到CB基因組的質(zhì)粒同源序列（IPS812）；CB質(zhì)粒編碼多個(gè)IV型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白1314，這些蛋白分泌到宿主細(xì)胞質(zhì)后，參與調(diào)控細(xì)胞功能15。長(zhǎng)期以來，CB質(zhì)粒（包括IPS）被認(rèn)為可能是菌體生長(zhǎng)或胞內(nèi)寄生所需的關(guān)鍵因子，又或者可能跟CB的環(huán)境耐受和所引起的疾病種類（急性Q熱或慢性Q熱）相關(guān)。由于培養(yǎng)困難及缺少CB質(zhì)粒的遺傳操作方法，CB質(zhì)粒及其編碼基因的生物學(xué)功能和致病機(jī)制均缺乏研究。近年來，無生命培養(yǎng)基ACCM1617培養(yǎng)CB方法的建立，推動(dòng)了CB的遺傳學(xué)研究進(jìn)展，為研究CB基因的功能創(chuàng)造了機(jī)遇。本論文參考國(guó)外已有的CB遺傳操作方法1819，通過基因工程技術(shù)構(gòu)建CB穿梭載體，建立了CB的遺傳轉(zhuǎn)化方法；利用質(zhì)粒相似不兼容機(jī)制2022，成功構(gòu)建了CB內(nèi)源質(zhì)粒QPH1缺失突變體，并在體內(nèi)、外對(duì)CB質(zhì)粒缺失突變體的表型和毒力變化等進(jìn)行了初步的探討；利用基因敲除和定點(diǎn)突變等技術(shù)，對(duì)CB內(nèi)源質(zhì)粒QPH1的復(fù)制與分裂調(diào)控區(qū)進(jìn)行了深入的探討。第一章，基于ECOLI質(zhì)粒PMMB20723，構(gòu)建含RSF1010I的貝氏柯克斯體自主穿梭載體，建立貝氏柯克斯體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。首先，利用PCR技術(shù)分別擴(kuò)增綠色熒光蛋白基因（EGFP）、卡那霉素抗性基因（KANR）、CB組成型表達(dá)基因啟動(dòng)子P311和P1169四段序列，以及含RSF1010I的載體骨架P207；然后，用融合PCR技術(shù)將四段序列融合為“P311EGFPP1169KANR”串聯(lián)序列；最后，用限制性核酸內(nèi)切酶KPNI和XHOI酶切“P311EGFPP1169KANR”串聯(lián)序列，連接至同樣雙酶切的載體骨架P207上，構(gòu)建穿梭載體P207GK。將穿梭載體P207GK電轉(zhuǎn)化至CBGRITAII相株，用無生命培養(yǎng)基ACCM2進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，利用倒置熒光顯微鏡觀察EGFP基因的表達(dá)，傳代至EGFP基因高表達(dá)時(shí)，用單層半固體“ACCM2KAN瓊脂”平板克隆分純CB轉(zhuǎn)化株；結(jié)果成功構(gòu)建了自主的CB穿梭載體，獲得了穩(wěn)定表達(dá)EGFP的CB轉(zhuǎn)化株，并完成了克隆分純。表明我們成功建立了CB遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，為后續(xù)用遺傳學(xué)方法研究CB奠定了基礎(chǔ)。第二章，生物信息學(xué)分析本室CBGRITAII相株質(zhì)粒全長(zhǎng)序列，確定該質(zhì)粒為QPH1（GENEBANKACCESSIONNOAE016829），BLAST比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒的CBUA0036～CBUA0039A序列片段在IPS中缺失，但在4種質(zhì)粒（QPH1，QPRS，QPDG，QPDV）中存在且高度保守，推測(cè)該段序列可能是調(diào)控CB質(zhì)粒復(fù)制與分裂的功能區(qū)，包含復(fù)制起始位點(diǎn)序列和相關(guān)質(zhì)粒分裂調(diào)控蛋白基因。利用PCR擴(kuò)增技術(shù)，從質(zhì)粒QPH1上擴(kuò)增獲得包含CBUA0036～CBUA0039A序列的片段，作為同源型質(zhì)粒的骨架（命名為PQ）；同時(shí)利用融合PCR擴(kuò)增技術(shù)，使EGFP基因、KANR基因、P311和P1169啟動(dòng)子，以及PUCI序列融合，形成“P311EGFPP1169KANRPUCI”串聯(lián)序列；把串聯(lián)序列亞克隆至載體骨架PQ上，構(gòu)建新型穿梭載體PQGK。將新型穿梭載體PQGK電轉(zhuǎn)化至CBGRITAII相菌中，用含KAN的無生命培養(yǎng)基ACCM2進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，通過熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)新型穿梭載體PQGK能在CB中穩(wěn)定地傳代，熒光激發(fā)下使CB轉(zhuǎn)化菌呈現(xiàn)綠色熒光，這說明新型穿梭載體PQGK上的CBUA0036～CBUA0039A序列片段含有PQGK質(zhì)粒的復(fù)制起始位點(diǎn)序列（I）。對(duì)轉(zhuǎn)化菌克隆分純后，用QPH1質(zhì)粒特異性引物對(duì)CB克隆株進(jìn)行PCR鑒定，未能檢測(cè)到QPH1質(zhì)粒，說明CB克隆株中的QPH1質(zhì)粒已經(jīng)丟失，獲得了CB內(nèi)源質(zhì)粒QPH1缺失突變株CBGRITAIIPQGK；利用SYBRGREEN絕對(duì)定量QPCR技術(shù)分別測(cè)定CB野生株中QPH1質(zhì)粒和突變株CBGRITAIIPQGK中PQGK質(zhì)粒的相對(duì)拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)QPH1與PQGK質(zhì)粒都只有單拷貝；以上數(shù)據(jù)說明QPH1與PQGK質(zhì)粒具有相同的復(fù)制與分裂調(diào)控機(jī)制，兩者在CB中不能共存，表明CBUA0036～CBUA0039A這段序列能嚴(yán)格地調(diào)控質(zhì)粒QPH1的復(fù)制、分裂及相似不兼容。用QPCR技術(shù)測(cè)定突變株CBGRITAIIPQGK在細(xì)胞外（ACCM2）和細(xì)胞內(nèi)（BGM）的增殖能力，發(fā)現(xiàn)突變株和野生株無論是在囊泡形成與生長(zhǎng)，還是在CB菌體增殖方面，均無明顯無差別，這結(jié)果提示CB質(zhì)粒QPH1的大部分序列（CBUA0001～CBUA0034A，＞85％）與CB在胞內(nèi)和胞外的正常生長(zhǎng)無關(guān)。通過體內(nèi)（SCID小鼠）和體外（THP1細(xì)胞）實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)突變株的毒力下降，提示QPH1質(zhì)粒是CB的一個(gè)毒力因子。第三章，以穿梭載體PQGK為基礎(chǔ)，深入探索CBUA0036～CBUA0039A這段序列調(diào)控QPH1質(zhì)粒復(fù)制和分裂的機(jī)制。通過基因敲除或序列刪除的方法，對(duì)穿梭質(zhì)粒PQGK上的CBUA0036～CBUA0039A這段序列進(jìn)行不同程度地刪減，構(gòu)建一系列穿梭載體PQGK的突變體，命名為PQGKD1～PQGKD17。將這些穿梭載體分別電轉(zhuǎn)化至CBGRITAII，用含KAN的ACCM2培養(yǎng)基進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，通過熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，當(dāng)EGFP基因高表達(dá)時(shí)，對(duì)CB轉(zhuǎn)化菌進(jìn)行克隆分純；之后對(duì)CB克隆株進(jìn)行PCR鑒定分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有14個(gè)穿梭載體（PQGKD1～PQGKD14）能成功轉(zhuǎn)化CB并穩(wěn)定傳代；序列比較分析顯示，只需含最短為600BP的序列（介于CBUA0036和CBUA0037之間）即可使穿梭載體PQGKD14在CB內(nèi)穩(wěn)定地傳代，而含更短序列片段的穿梭載體（PQGKD15～PQGKD17）無法獲得CB轉(zhuǎn)化菌，說明這段600BP的序列包含CB質(zhì)粒QPH1的復(fù)制起始位點(diǎn)序列（I）。隨后對(duì)已經(jīng)克隆分純的CB克隆菌進(jìn)行PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)穿梭載體PQGKD1和PQGKD5均能敲除CBGRITAII內(nèi)源質(zhì)粒QPH1；穿梭載體PQGKD7～D8、PQGKD11～D14與QPH1質(zhì)粒共存，到目前為止，以上結(jié)果表明QPH1質(zhì)粒的復(fù)制、分裂和相似不兼容，除了復(fù)制起始位點(diǎn)（I）外，還受到其它未知因子的調(diào)控（實(shí)驗(yàn)進(jìn)行中，詳細(xì)結(jié)果待補(bǔ)充）。第四章，在前期研究的基礎(chǔ)上，利用基因克隆技術(shù)，把穿梭載體PQGK上的KANR基因替換成RIFR基因，構(gòu)建新型穿梭載體PQGR，并電轉(zhuǎn)化CBGRITAII及克隆分純。在ACCM2培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)在相同時(shí)間內(nèi)，PQGR轉(zhuǎn)化株CBGRITAIIPQGR的增殖能力比PQGK轉(zhuǎn)化株CBGRITAIIPQGK要明顯下降；感染BGM后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在胞內(nèi)只能形成細(xì)小的空泡，未能進(jìn)一步發(fā)展成經(jīng)典的大空泡，且CB菌體增殖能力明顯下降；感染THP1細(xì)胞后，無空泡形成，亦未能檢測(cè)到CB菌體在細(xì)胞內(nèi)增殖。上述結(jié)果說明，RIFR基因的表達(dá)產(chǎn)物ADP核糖基化酶在CB內(nèi)可能具有核糖基化作用，影響CB正常的生物合成，使CB減毒，對(duì)CB感染細(xì)胞后空泡的發(fā)展和菌體增殖具有顯著的抑制作用，表明RIFR基因不適合作為CB遺傳轉(zhuǎn)化研究中的藥物篩選標(biāo)記。綜上所述，本研究成功構(gòu)建了基于RSF1010I的自主穿梭載體P207GK，并利用該穿梭載體建立了CB的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)；隨后，成功構(gòu)建了與CB質(zhì)粒QPH1具有同源序列（CBUA0036～CBUA0039A）的新型穿梭質(zhì)粒PQGK，并利用該穿梭載體成功敲除CB內(nèi)源質(zhì)粒QPH1，獲得QPH1質(zhì)粒缺失突變體；對(duì)CBUA0036～CBUA0039A這段序列進(jìn)行深入的研究后，發(fā)現(xiàn)QPH1質(zhì)粒的復(fù)制起始位點(diǎn)序列區(qū)；此外，實(shí)驗(yàn)過程中還發(fā)現(xiàn)RIFR基因編碼產(chǎn)物ADP核糖基化酶對(duì)CB的生物合成具有顯著的影響，不適合用來作為CB遺傳轉(zhuǎn)化的藥物篩選標(biāo)記。本研究為進(jìn)一步深入研究CB質(zhì)粒的生物學(xué)功能和致病機(jī)制提供新的遺傳學(xué)工具和方法。

簡(jiǎn)介：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文藍(lán)狐多重感染的病原學(xué)及主要病原的分子生物學(xué)特性研究姓名崔金生申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師朱瑞良20080612藍(lán)狐多重感染的病原學(xué)及主要病原的分子生物學(xué)特性研究二、藍(lán)狐綠膿桿菌主要血清學(xué)診斷方法的建立與I艋床應(yīng)用取上述試驗(yàn)所分離的主要病原菌綠膿桿菌的代表菌株ZB4，分別制備全菌OK抗原及菌體O抗原，經(jīng)分別強(qiáng)化免疫接種家兔制備高效價(jià)抗血清，進(jìn)行與待檢菌株的玻片凝集反應(yīng)、免疫熒光抗體反應(yīng)姒及瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)AGP等方面的免疫檢驗(yàn)，結(jié)果在同種細(xì)菌間的熒光抗體檢驗(yàn)顯示出了特異的黃綠色熒光反應(yīng)；玻片凝集反應(yīng)中出現(xiàn)了特異凝集；在瓊脂擴(kuò)散檢驗(yàn)中出現(xiàn)特異的免疫沉淀線。本研究建立了藍(lán)狐綠膿桿菌玻板凝集、IFA、AGP的快速診斷方法，補(bǔ)充了傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)檢測(cè)的方法，為這些病原的快速、準(zhǔn)確診斷奠定了基礎(chǔ)。三、藍(lán)狐綠膿桿菌ZB4株16SRRNA基因的序列測(cè)定及系統(tǒng)進(jìn)化分析病原學(xué)研究結(jié)果表明綠膿桿菌是影響規(guī)模化藍(lán)狐養(yǎng)殖場(chǎng)多重感染的主要病原之一，為進(jìn)一步研究其分子生物學(xué)特性，本試驗(yàn)利用原核生物16SRRNA基因通用引物對(duì)分離純化的藍(lán)狐致病性綠膿桿菌菌株ZB4進(jìn)行16SRRNA基因的克隆及序列分析。采用DNASTAR軟件將獲得的序列與選取的核苷酸同源性較高的序列進(jìn)行同源性比對(duì)，采用MEGA31軟件生成同源序列的進(jìn)化樹。結(jié)果顯示該菌株與假單胞菌屬的9個(gè)代表菌株的同源性均很高，在987％992％之間，在所構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹上，ZB4菌株與綠膿桿菌PSEUDOMONASAERUGINOSAAJ249451的距離最近，位于同一分支，其同源性達(dá)992％。從分子水平上鑒定菌株ZB4為綠膿桿菌PSEUDOMONASAERUGINOSA。關(guān)鍵詞藍(lán)狐多重感染；血清學(xué)；綠膿桿菌；16SRRNA分子生物學(xué)2

簡(jiǎn)介：目的初步研究分枝桿菌噬菌體GUO1生物學(xué)特性及環(huán)狀基因組特征。方法測(cè)定分枝桿菌噬菌體GUO1的最佳感染復(fù)數(shù)、一步生長(zhǎng)曲線以及對(duì)紫外線、氯仿、酒精、溫度、PH的敏感性。采用鳥槍法和重疊群組裝策略完成GUO1全基因組測(cè)序；使用DNASTAR、TRNANSE、PROMOTERPREDICTIONS、TRF、GLIMMER、BLAST軟件分別對(duì)噬菌體的一般基因組學(xué)特征、TRNA、啟動(dòng)子、串聯(lián)重復(fù)序列和編碼基因進(jìn)行分析；運(yùn)用BLAST軟件檢索與GUO1基因組相似的噬菌體并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，推斷GUO1的分群。結(jié)果GUO1對(duì)紫外線有較強(qiáng)抵抗力，對(duì)酒精、氯仿和高溫敏感；最適溫度為37℃，最適PH為70，最佳感染復(fù)數(shù)為001；一步生長(zhǎng)曲線顯示潛伏期120MIN，裂解期120MIN，裂解量為47個(gè)。噬菌體GUO1的基因組為全長(zhǎng)40086NT的環(huán)狀雙鏈DNA，屬于G群分枝桿菌噬菌體；GUO1基因組中含有59個(gè)推定基因，7個(gè)啟動(dòng)子序列和3個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列。結(jié)論GUO1是首次發(fā)現(xiàn)的具有環(huán)狀雙鏈DNA結(jié)構(gòu)的G群分枝桿菌噬菌體，完成了GUO1的全基因組測(cè)序，并初步分析了GUO1的基因組特征和生物學(xué)特性，發(fā)現(xiàn)GUO1具有復(fù)蘇和殺滅結(jié)核分枝桿菌的潛力。

簡(jiǎn)介：研究目的本文采用智能材料壓電陶瓷裝置，通過檢測(cè)MC3T3E1成骨樣細(xì)胞增殖活性、細(xì)胞分化特異基因表達(dá)探討三維培養(yǎng)條件下細(xì)胞對(duì)不同力學(xué)強(qiáng)度的生物學(xué)響應(yīng)。材料與方法1采用冷凍干燥制備不同質(zhì)量比殼聚糖羥基磷灰石脫鈣骨基質(zhì)CHITOSANHYDROXYAPATITEDEMINERALIZEDBONEMATRIX，CSHADBM復(fù)合支架材料。掃描電鏡SCANNINGELECTRONMICROSCOPY，SEM觀察其形貌，MICROCT分析支架的微結(jié)構(gòu)，材料試驗(yàn)機(jī)測(cè)試不同質(zhì)量比CSHADBM復(fù)合材料的壓縮彈性模量和壓縮強(qiáng)度。采用體外培養(yǎng)細(xì)胞的方法，將成骨前體細(xì)胞MC3T3E1直接接種到CSHADBM三維支架材料上，共培養(yǎng)1、3、5、7D，采用MTS方法繪制細(xì)胞增殖曲線，SEM、組織化學(xué)染色觀察細(xì)胞形態(tài)。選擇后期實(shí)驗(yàn)用材料及最佳加載時(shí)間。2采用有限元FINITEELEMENT，F(xiàn)E分析方法計(jì)算三維THREEDIMENSIONAL，3D支架內(nèi)部單個(gè)細(xì)胞所受到的作用力大小及相關(guān)力學(xué)參數(shù)，根據(jù)此數(shù)據(jù)來優(yōu)化工程化骨組織體外構(gòu)建的力學(xué)刺激條件，采用智能材料壓電陶瓷對(duì)細(xì)胞支架材料復(fù)合物進(jìn)行力學(xué)加載。3根據(jù)CSHADBM復(fù)合支架材料生物相容性研究結(jié)果和實(shí)驗(yàn)室前期結(jié)果，將加載條件設(shè)定為每次1H，1次D，連續(xù)6D，頻率為1HZ，工作應(yīng)變?yōu)?ΜΕ、1200ΜΕ、2800ΜΕ、7000ΜΕ，用MTS檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，采用RTPCR方法測(cè)定特異基因骨形態(tài)發(fā)生蛋白2BONEMPHOGEICPROTEIN2，BMP2、RUNX2或稱核心結(jié)合因子CEBINDINGFACTAL，CBFA1、堿性磷酸酶ALKALINEPHOSPHATASE，ALP、Ⅰ型膠原COLLAGENTYPEⅠ，COLⅠ及骨鈣素OSTEOCALCIN，OCN的基因表達(dá)情況，采用WESTERNBLOT方法測(cè)定BMP2、RUNX2的蛋白表達(dá)情況。研究結(jié)果1通過冷凍干燥法制備出具有良好相互連通孔隙結(jié)構(gòu)100ΜM的3D材料。CSHADBM復(fù)合材料具有連通的多孔結(jié)構(gòu)，孔隙率為48％65％，材料的平均壓縮模量和最終壓縮強(qiáng)度分別為36KPA和1124KPA。在DBM一定的情況下，隨著HA量的增加，體積分?jǐn)?shù)VOLUMEFRACTION增加，支架孔壁厚度TRABECULARTHICKNESS，TBTH和支架孔隙間隙TRABECULARSEPARATION增加，但支架表面積體積比BONESURFACEVOLUMERATIO，BSBV減少，總的孔隙率TOTALPOSITY降低。2參照生理載荷范圍，根據(jù)有限元計(jì)算的支架材料內(nèi)部應(yīng)變分布，確定實(shí)驗(yàn)表觀加載應(yīng)變?yōu)?ΜΕ、1200ΜΕ、2800ΜΕ、7000ΜΕ。施加1200ΜΕ表觀加載應(yīng)變時(shí)，內(nèi)部應(yīng)變60％在1000ΜΕ2000ΜΕ之間，但主要集中在1000ΜΕ；施加2800ΜΕ表觀加載應(yīng)變時(shí)，內(nèi)部應(yīng)變60％在1000ΜΕ2000ΜΕ之間，但主要集中在2000ΜΕ；施加7000ΜΕ表觀加載應(yīng)變時(shí)，內(nèi)部應(yīng)變60％大于5000ΜΕ。四組樣品在支架孔壁處存在應(yīng)力集中現(xiàn)象。3細(xì)胞增殖曲線說明7000ΜΕ的壓縮應(yīng)變抑制細(xì)胞增殖。與靜態(tài)培養(yǎng)相比，在1200ΜΕ、2800ΜΕ的壓縮應(yīng)變作用下，細(xì)胞增殖速度快，數(shù)量增多。4RTPCR以及WESTERNBLOT結(jié)果顯示，與靜態(tài)培養(yǎng)組相比，1200ΜΕ、2800ΜΕ壓縮應(yīng)變促進(jìn)了成骨分化特異基因BMP2、RUNX2、ALP、COLⅠ及OCN的表達(dá)，2800ΜΕ壓縮應(yīng)變條件下表達(dá)最強(qiáng)，而7000ΜΕ壓縮應(yīng)變抑制其表達(dá)。研究結(jié)論1六種材料中3WT％HA材料組具有理想的孔隙結(jié)構(gòu)100ΜM。MC3T3E1成骨前體細(xì)胞易在CSHADBM三維支架材料上黏附、增殖，表明該支架材料具有良好的生物相容性。根據(jù)材料結(jié)構(gòu)參數(shù)、力學(xué)特性及細(xì)胞相容性結(jié)果確定質(zhì)量比3315組的支架材料作為后期實(shí)驗(yàn)材料。根據(jù)細(xì)胞增殖曲線確定壓縮應(yīng)變時(shí)間為6D。2壓縮應(yīng)變可促進(jìn)成骨，為研究力學(xué)作用增加骨強(qiáng)度提供了一個(gè)分子模型。合適的力學(xué)刺激作用下細(xì)胞的生物學(xué)響應(yīng)表明力學(xué)刺激在促進(jìn)骨折愈合中的重要性。研究結(jié)果還表明超生理力學(xué)刺激抑制細(xì)胞的增殖。3通過有限元分析方法得到了支架材料局部各處的應(yīng)變分布，計(jì)算出細(xì)胞在三維培養(yǎng)條件下受到的主要的力學(xué)作用，確定表觀加載應(yīng)變。合適的力學(xué)刺激1200ΜΕ、2800ΜΕ作用下促進(jìn)細(xì)胞的增殖分化，而超生理力學(xué)刺激7000ΜΕ抑制細(xì)胞增殖。由此說明利用有限元分析方法探索骨組織工程中的微觀力學(xué)環(huán)境是一種較為有效的途徑。

簡(jiǎn)介：新城疫NEWCASTLEDISEASE，ND是禽類重要的致死性病毒性傳染病，其病原為新城疫病毒NEWCASTLEDISEASEVIRUS，NDV。NDV宿主范圍廣泛，可感染幾乎所有鳥類。野鳥不僅是NDV的自然宿主，還在NDV傳播和進(jìn)化過程中扮演重要角色，所以野鳥源新城疫病毒是ND流行病學(xué)研究的一個(gè)重要部分，也是容易被忽視的部分。本研究中所用的20株NDV分離自黑龍江省和吉林省的野鳥樣品。本研究對(duì)分離到的20株NDV進(jìn)行了全基因組序列測(cè)定和遺傳進(jìn)化分析，并根據(jù)CLASSⅡ類NDV的分子特征和遺傳進(jìn)化分析選出5株（基因Ⅲ型MALLARDCHHLJ38306、基因ⅦD型WBCHHLJ00106、基因ⅦB型MALLARDCHHLJ12706、WBCHJL0107和MALLARDCHHLJ36305）進(jìn)行致病性試驗(yàn)、單因子血清制備及抗原性分析。測(cè)序結(jié)果顯示，20株NDV基因組長(zhǎng)度有三種類型，分別為15186NT、15192NT和15198NT其中15株NDV的F蛋白裂解位點(diǎn)為112RRQKRF117，1株NDV的F蛋白裂解點(diǎn)為112RRQRRF117，屬于典型的強(qiáng)毒株裂解位點(diǎn)其余4株NDV的F蛋白裂解位點(diǎn)為112ERQERL117，屬于典型的弱毒株裂解位點(diǎn)。F基因遺傳進(jìn)化分析顯示4株具有弱毒裂解位點(diǎn)的NDV屬于CLASSⅠ類B亞型16株具有強(qiáng)毒裂解位點(diǎn)的NDV屬于CLASSⅡ類NDV，其中1株為基因Ⅲ型，4株為基因ⅦD型，其余11株為基因ⅦB型。遺傳進(jìn)化分析表明，與CLASSⅠ分離株高度相似的NDV在野鳥和家禽均有分布，CLASSⅠ分離株與CLASSⅠ類5個(gè)參考株的全基因組及6個(gè)結(jié)構(gòu)基因的開放閱讀框架區(qū)核酸序列比對(duì)分析表明，CLASSⅠ分離株與參考株之間存在一定差異。但CLASSⅠ分離株與同亞型CLASSⅠ類NDV之間遺傳距離差異小于3％，具有較高的F基因核苷酸一致性，表明本研究中分離的4株CLASSⅠ類NDV在遺傳進(jìn)化上并沒有形成獨(dú)立的分支，推測(cè)是中國(guó)CLASSⅠ類B亞型NDV傳播到野鳥并適應(yīng)產(chǎn)生的。近幾年我國(guó)廣東、湖北、江西、吉林和貴州等地區(qū)分離到的CLASSⅠ類NDV，與本研究的CLASSⅠ類分離株高度相似，表明該基因亞型NDV目前在中國(guó)分布比較廣泛。此外遺傳進(jìn)化分析表明，分離的CLASSⅡ類基因Ⅲ型NDV與疫苗株MUKTESWAR遺傳進(jìn)化關(guān)系很近，但毒力強(qiáng)于MUKTESWAR。本實(shí)驗(yàn)分離的CLASSⅡ類基因ⅦB型NDV與2013年在以色列分離到的基因ⅦB型NDVPHEASANTHISRAEL2013746828遺傳關(guān)系最近，分離的CLASSⅡ類基因ⅦD型NDV與2007年在塞爾維亞分離到的基因ⅦD型NDVSERBIA10382007遺傳關(guān)系最近。與CLASSⅡ類基因Ⅶ型分離株高度相似的NDV在野鳥和家禽均有分布，表明該基因型NDV可以在野鳥和家禽之間傳播。致病指數(shù)測(cè)定結(jié)果顯示MALLARDCHHLJ38306、WBCHHLJ00106、MALLARDCHHLJ12706、WBCHJL0107和MALLARDCHHLJ36305的ICPI值均大于1，表明這5株分離株均為強(qiáng)毒株。對(duì)F48E9、GOCHHLJLL0108、MALLARDCHHLJ38306、WBCHHLJ00106、MALLARDCHHLJ12706、WBCHJL0107和MALLARDCHHLJ36305進(jìn)行F蛋白和HN蛋白抗原位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)蛋白抗原位點(diǎn)在不同基因型NDV之間僅有1個(gè)氨基酸不同，HN抗原位點(diǎn)在不同基因型NDV之間出現(xiàn)多個(gè)氨基酸不同。交叉中和試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離株MALLARDCHHLJ36305和MALLARDCHHLJ38306與F48E9具有明顯的抗原差異MALLARDCHHLJ36305與WBCHJL0107具有明顯的抗原差異，MALLARDCHHLJ38306與WBCHJL0107具有明顯的抗原差異其它毒株之間抗原差異較小或沒有差異，表明分離的基因Ⅶ型NDV與同一基因型毒株之間沒有抗原差異或抗原差異較小。本研究表明，有多種不同基因型的NDV存在于野鳥群體中，包括CLASSⅠ類和CLASSⅡ類，既有強(qiáng)毒株，也有弱毒株，提示野鳥在新城疫病毒傳播過程中具有重要作用。本研究為進(jìn)一步研究野鳥在NDV流行病學(xué)中的作用及對(duì)我國(guó)新城疫的防控提供了依據(jù)。

簡(jiǎn)介：溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文STNFRⅡGAD融合蛋白聚合體表達(dá)、制備及生物學(xué)特性研究姓名陸月申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)遺傳學(xué)指導(dǎo)教師高基民；吳小兵201105溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文程度是二聚體融合蛋白的24倍。結(jié)論成功構(gòu)建了PDC316STNFRIIGAD和PRECIRESDHFRSTNFRIIGAD融合基因質(zhì)粒，并分別對(duì)應(yīng)在腺病毒表達(dá)系統(tǒng)及CHO／DHFR’真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)了有生物學(xué)活性的融合蛋白的表達(dá)?！⒘吮容^完善的蛋白純化系統(tǒng)。從收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清開始，經(jīng)過硫酸銨沉淀，金屬離子親和層析純化，分子篩純化得到相對(duì)高純度，高質(zhì)量的STNFRIIGAD融合蛋白。并完善了檢測(cè)手段，通過蛋白點(diǎn)雜交，WESTEMBLOTTING免疫印跡實(shí)驗(yàn)，L929細(xì)胞測(cè)活實(shí)驗(yàn)等，檢測(cè)了融合蛋白的表達(dá)情況和比活性。研究了三聚體重組蛋白STNFRIIGAD的一些生物學(xué)特性，通過超速分析離心得到三聚體融合蛋白的分子量為165KD，通過BIACORE實(shí)驗(yàn)證明三聚體重組蛋白STNFRIIGAD與腫瘤壞死因子的親和力高于二聚體融合蛋白STNFRIIFC兩倍以上。關(guān)鍵詞融合蛋白；可溶性腫瘤壞死因子受體II脂聯(lián)素；真核表達(dá)；生物學(xué)活性；表達(dá)系統(tǒng)4

簡(jiǎn)介：金黃色葡萄球菌STAPHYLOCOCCUSAUREUS是世界范圍內(nèi)化膿感染中最常見的病原菌，能引起諸多局部化膿性、系統(tǒng)性感染疾病，甚至全身感染。近年來，耐多種抗生素的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA急劇增多并遍布全球，迅速成為世界范圍內(nèi)醫(yī)院感染的主要病原菌。不僅如此，健康人群MRSA攜帶率也在逐年攀升。我國(guó)是MRSA高度流行的國(guó)家，針對(duì)醫(yī)院來源的MRSA研究比較廣泛，但是對(duì)于社區(qū)健康人群攜帶的MRSA研究相對(duì)較少。通過對(duì)社區(qū)來源的MRSA進(jìn)行耐藥性、分子分型、毒力基因檢測(cè)等方面的研究，有助于了解我國(guó)健康人群中MRSA菌株的流行病學(xué)現(xiàn)狀，為指導(dǎo)臨床合理用藥，制定感染預(yù)防和控制措施，最終延緩和減少耐藥現(xiàn)象提供流行病學(xué)和分子生物學(xué)參考依據(jù)。目的1描述山東省城市和農(nóng)村健康成年人金葡菌及MRSA攜帶率、SPA型別、耐藥性等特征，為山東地區(qū)金葡菌及MRSA感染治療提供可靠依據(jù)2了解城市和農(nóng)村來源金葡菌耐藥性、SPA型別、PVL基因攜帶等方面的特征3探索不同SPA型別菌株耐藥性差異，尋找菌株耐藥性差異的分子來源。方法1使用平板培養(yǎng)基對(duì)金葡菌和MRSA進(jìn)行篩選，應(yīng)用飛行時(shí)間質(zhì)譜分析對(duì)所分離的金葡菌所屬種屬進(jìn)行驗(yàn)證，檢測(cè)DNA攜帶MECA基因的情況對(duì)分離的MRSA進(jìn)行鑒定2采用96孔板稀釋法對(duì)所鑒定的金葡菌和MRSA菌株進(jìn)行青霉素、苯唑西林、頭孢西丁、萬古霉素、克林霉素、四環(huán)素、達(dá)托霉素、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明等常用抗生素最小抑菌濃度檢測(cè)，結(jié)果用敏感S、中介敏感I和耐藥R表示耐三種及以上藥物的菌株參照定義判定為多耐藥菌株MDR并對(duì)結(jié)果進(jìn)行城鄉(xiāng)比較3采用PCR法對(duì)分離株進(jìn)行SPA分型，并將SPA型別與樣本城鄉(xiāng)來源、耐藥性等因素進(jìn)行比較聯(lián)系4采用PCR法對(duì)分離株進(jìn)行PVL攜帶檢測(cè)，并進(jìn)行城鄉(xiāng)比較5使用EXCEL2016對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和匯總，使用STATA130對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和繪圖。結(jié)果1本研究共采集到有效鼻腔拭子樣本1241份，其中城市人群樣本473份、農(nóng)村人群樣本768份。共檢出金葡菌251株，檢出率2023％，檢出MRSA33株，總檢出率266％。2MRSA中多耐藥菌株占8788％，對(duì)青霉素、紅霉素、克林霉素、苯唑西林、四環(huán)素、頭孢西丁、氯霉素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、鏈霉素500、復(fù)方新諾明、達(dá)托霉素、萬古霉素的耐藥率分別為10000％、9394％、7879％、6061％、5758％、5758％、3939％、3636％、3333％、2727％、303％、000％、000％對(duì)氯霉素中介敏感率為5152％。MSSA中多耐藥菌株占5688％，對(duì)上述抗生素的耐藥率分別為8945％、6284％、4174％、321％、2569％、459％、1560％、2385％、1009％、596％、2248％、000％、000％，對(duì)氯霉素中介敏感率為6330％。MRSA耐藥性均顯著高于MSSA的抗生素有苯唑西林、克林霉素、紅霉素、頭孢西丁、鏈霉素500和紅霉素克林霉素。農(nóng)村樣本分離的MRSA對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥性顯著高于城市MRSA，其他抗生素耐藥性未發(fā)現(xiàn)顯著性差異。農(nóng)村樣本分離的MSSA對(duì)的耐藥性顯著高于城市MSSA的抗生素有苯唑西林、四環(huán)素、氯霉素、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明和頭孢西丁，耐藥性顯著低于城市MSSA的抗生素有鏈霉素500和慶大霉素，其他抗生素耐藥性未發(fā)現(xiàn)顯著性差異。3金葡菌株中分離率較高的SPA型別T437、T002和T899分離率分別為1633％、1474％、717％，其余尚有T011、T078、T368等50多種型別。城市樣本中MRSA分離株的主要型別是T437，而農(nóng)村MRSA的主要型別是T437和T899。城市MSSA多數(shù)為T002，而農(nóng)村MSSA以T002為主。結(jié)果顯示，SPA分型的差異不僅體現(xiàn)在MRSA與MSSA之間，城鄉(xiāng)之間亦呈現(xiàn)顯著性差異。主要的3種SPA型別中MDR的比率均高于80％，且均對(duì)青霉素、紅霉素和克林霉素表現(xiàn)較高的耐藥性。SPA型別為T899的菌株普遍耐藥性較高，T437次之，T002的菌株耐藥性較低，僅對(duì)慶大霉素和環(huán)丙沙星耐藥性高于T437。4金葡菌分離株中PVL基因陽(yáng)性率為1594％，其中城市人群分離株P(guān)VL基因攜帶陽(yáng)性率388％，農(nóng)村人群分離株P(guān)VL攜帶陽(yáng)性率2297％。城市人群金葡菌分離株P(guān)VL基因陽(yáng)性率顯著低于農(nóng)村。MRSA分離株P(guān)VL基因攜帶率為6667％，顯著高于MSSA分離株865％的攜帶率。討論1MRSA在金葡菌中的檢出率為1315％。城市和農(nóng)村兩部分人群金葡菌和MRSA攜帶率沒有顯著性差異2當(dāng)使用抗生素治療金葡菌感染疾病時(shí)，青霉素、紅霉素、氯霉素等傳統(tǒng)藥物已不可選，克林霉素、苯唑西林、四環(huán)素和頭孢西丁等藥物也可能對(duì)MRSA失效，環(huán)丙沙星和復(fù)方新諾明普遍效果較好，達(dá)托霉素對(duì)MRSA和MSSA生長(zhǎng)表現(xiàn)完全抑制，萬古霉素仍是MRSA治療的最后一道防線。城鄉(xiāng)MRSA分離株耐藥性差異不大，農(nóng)村樣本MSSA菌株耐藥性總體高于城市3金黃色葡萄球菌在SPA基因位點(diǎn)呈現(xiàn)較強(qiáng)的序列重復(fù)性和較高的多態(tài)性。研究發(fā)現(xiàn)，SPA分型的差異不僅體現(xiàn)在MRSA與MSSA之間，城鄉(xiāng)之間亦呈現(xiàn)顯著性差異，不同SPA型別所表現(xiàn)的耐藥性亦有顯著差異SPA基因型別的差異可能是不同來源菌株耐藥性差異的原因4MRSA的PVL攜帶率顯著高于MSSA，農(nóng)村人群攜帶的金葡菌分離株P(guān)VL基因攜帶率更高，可能造成感染后癥狀更重，預(yù)后更加不良。結(jié)論山東地區(qū)社區(qū)健康成年人金葡菌攜帶率較高，而MRSA攜帶率較為一般，與我國(guó)醫(yī)院MRSA檢出率一致。城鄉(xiāng)人群在金葡菌和MRSA攜帶率方面沒有差異，而農(nóng)村樣本分離的MSSA表現(xiàn)了較高的耐藥率。菌株普遍表現(xiàn)對(duì)青霉素、紅霉素和克林霉素較高的耐性，對(duì)萬古霉素、達(dá)托霉素敏感性較好。SPA基因型別以T437、T899和T002為主，前兩者主要存在于MRSA，后者于MSSA。由于城鄉(xiāng)以及MRSA和MSSA之間表現(xiàn)的耐藥率和耐藥譜的差異，與其優(yōu)勢(shì)型別所表現(xiàn)的耐藥率和耐藥譜的差異呈現(xiàn)高度一致性，推測(cè)SPA型別的差異是造成不同來源不同性質(zhì)的菌株耐藥率和耐藥譜差異的原因之一。建議臨床治療時(shí)，除慎用青霉素、紅霉素和克林霉素外，頭孢西丁、氯霉素、四環(huán)素等藥物也應(yīng)酌情應(yīng)用，預(yù)期達(dá)托霉素療效較好，萬古霉素仍是MRSA感染的最后一道防線。

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簡(jiǎn)介：核糖體RNA基因間區(qū)是研究物種分子生物學(xué)鑒定的常用重要指標(biāo)，它含量大，并且普遍存在于各種生物當(dāng)中，是物種系統(tǒng)分類學(xué)研究中最有用和最常用的靶基因序列。檢測(cè)手段的創(chuàng)新能夠迅速推動(dòng)物種鑒定領(lǐng)域的發(fā)展。本文介紹了三種基于DNA水平的物種鑒定及定量的檢測(cè)方法的研究。其中兩種物種鑒定方法為食源性致病菌，分子定量方法為線蟲相關(guān)。這三種方法分別是1）利用環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增方法特異性鑒定食品中小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的研究；2）利用交叉引物方法結(jié)合免疫雜交技術(shù)快速鑒定阪崎腸桿菌的研究；3）土壤線蟲基因組DNA提取方法與分子定量方法的改進(jìn)研究。1利用環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增方法特異性鑒定食品中小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的研究小腸結(jié)腸炎耶爾森菌YERSINIAENTEROCOLITICA是30年代引起注意的急性胃腸炎型食物中毒的病原菌，為人畜共患病。該菌易染人群為嬰幼兒，常引起發(fā)熱、腹痛和帶血的腹瀉。隨著我國(guó)的快速發(fā)展，進(jìn)出口貨物明顯增加。而目前檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌仍然沿用傳統(tǒng)的生理生化方法，不僅所需時(shí)間長(zhǎng)（約4天）而且浪費(fèi)人力。這己明顯不適合我國(guó)現(xiàn)狀。用分子生物學(xué)方法檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌無疑是更好的選擇。在本研究中，針對(duì)16S23SRRNA基因轉(zhuǎn)錄間區(qū)16S23SRRNAINTERNALTRANSCRIBEDSPACER，ITS序列，本學(xué)位論文研究設(shè)計(jì)和驗(yàn)證了一種環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（LOOPMEDIATEDISOTHERMALAPPLIFICAFION，LAMP）檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的方法。和PCR方法相比，該方法對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求低，僅需要簡(jiǎn)單操作即可高效快捷地完成。該方法靈敏度≥8CFUML，特異性為100％，經(jīng)大量樣品驗(yàn)證，與現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法一致，已成為國(guó)家進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫局新的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。2利用交叉引物方法結(jié)合免疫雜交技術(shù)快速鑒定阪崎腸桿菌的研究阪崎腸桿菌ENTEROBACTERSAKAZAKII是一種分布極為廣泛的腸道菌，特別在奶粉中的污染尤為嚴(yán)重。作為可嚴(yán)重危害生命安全的腸桿菌，由阪崎腸桿菌所引發(fā)疾病的致死病例可達(dá)4080以上。患者中又以嬰幼兒為眾，常常導(dǎo)致嬰兒腦膜炎、敗血癥等嚴(yán)重疾病。因此，全球范圍已經(jīng)開發(fā)了多種檢測(cè)鑒定阪崎腸桿菌的生理生化方法、PCR法以及LAMP法。但是這些方法都存在一些不足，如鑒定時(shí)間長(zhǎng)、檢測(cè)靈敏度低，和有害試劑的使用等。本學(xué)位論文針對(duì)阪崎腸桿菌16S23SRRNA基因轉(zhuǎn)錄間區(qū)序列，研究設(shè)計(jì)和驗(yàn)證了一種交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增CROSSPRIMINGAMPLIFICATION，CPA與免疫雜交分析技術(shù)IMMUNOBLOTTING相結(jié)合的阪崎腸桿菌鑒定方法。并且同時(shí)進(jìn)行了國(guó)家出入境檢驗(yàn)檢疫局行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的阪崎腸桿菌PCR鑒定實(shí)驗(yàn)，作為CPA檢測(cè)結(jié)果特異性與靈敏度的對(duì)照。結(jié)果表明，該CPA方法靈敏度為≥LOFGDNA或≥12CFUML，特異性為100，與現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法完全一致。而且，擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)只需要免疫雜交試紙條，在510MIN內(nèi)便可以知道結(jié)果。因此，該方法更適應(yīng)于野外以及現(xiàn)場(chǎng)樣品的檢測(cè)。3土壤線蟲基因組DNA提取方法與分子定量方法的改進(jìn)研究線蟲NEMATODE是一種在地球上存在數(shù)量極為巨大的多細(xì)胞真核生物。尤其在土壤中行使著各種不同的重要作用，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和碳元的代謝有著極為重要的作用。在這些線蟲中存在著一大類植物寄生性線蟲，它們可以導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)，全球平均每年造成157億美元的損失。因此，對(duì)土壤線蟲種類的鑒定就變得尤為重要。然而，雖然線蟲具有如此重要的作用，但是目前常用的線蟲鑒定方法仍舊是顯微鏡下線蟲形態(tài)觀察鑒定方法。該方法不僅需要消耗大量時(shí)間而且鑒定過程中需要使用多種對(duì)人身體健康有害的試劑。因此，最近許多研究報(bào)道提出以分子生物學(xué)鑒定方法替代形態(tài)學(xué)鑒定。但是，為了進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定的基因克隆測(cè)序，便需要PCR產(chǎn)生大量擴(kuò)增產(chǎn)物。因此，也就對(duì)線蟲基因組DNA的提取方法有了較高的要求。本實(shí)驗(yàn)通過針對(duì)秀麗隱桿線蟲（CAENHABDITISELEGANS）和昆蟲病原性線蟲（STEINERNEMACARPOCAPSE）18S28SRRNA基因轉(zhuǎn)錄間區(qū)序列，對(duì)現(xiàn)有的三種線蟲基因組DNA提取方法（酚仿法、氫氧化鈉法、吐溫20法）進(jìn)行比較，并提出了一種全新的改進(jìn)方法TRITONX100法。結(jié)果表明，在三種現(xiàn)在常用的線蟲基因組DNA提取方法中，酚仿法不適合進(jìn)行少量線蟲的基因組DNA提取，氫氧化鈉法提取基因組模板PCR擴(kuò)增量明顯低于吐溫20法，吐溫20法是三種方法中線蟲基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)量最高也是最穩(wěn)定的方法。但是，三種常用提取方法的PCR產(chǎn)物擴(kuò)增量均無法達(dá)到TRITONXL00提取方法的水平。因此，TRITONXL00線蟲基因組DNA改進(jìn)提取方法更適合線蟲基因的擴(kuò)增，更能夠保證克隆測(cè)序的順利進(jìn)行。根結(jié)線蟲ROOTKNOTNEMATODES被認(rèn)為是導(dǎo)致農(nóng)業(yè)損失最嚴(yán)重的一種線蟲。它通過寄生于植物的根系阻斷植物根系對(duì)土壤中水和養(yǎng)料的攝取，從而導(dǎo)致農(nóng)作物畝產(chǎn)量的嚴(yán)重降低。以南方根結(jié)線蟲MELOIDOGYNESPPRKN為例，它被認(rèn)為是植物“零承受”的土壤線蟲，因?yàn)?，南方根結(jié)線蟲將嚴(yán)重影響農(nóng)作物的生長(zhǎng)。每1000毫升土壤中，只要存在一條南方根結(jié)線蟲都將會(huì)嚴(yán)重降低農(nóng)作物的產(chǎn)量。因此，能夠準(zhǔn)確計(jì)算出土壤中南方根結(jié)線蟲數(shù)量，就成為治理南方根結(jié)線蟲的首要條件。分子生物學(xué)方法主要依靠熒光定量PCR技術(shù)，通過計(jì)算熒光激發(fā)的循環(huán)值CYCLETHRESHOLD，CT對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行分子定量。但是，由于目前采用CT值方法對(duì)樣品進(jìn)行定量分析時(shí)，普遍存在誤差較大、定量不準(zhǔn)確等問題。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)山東壽光地區(qū)土壤中南方根結(jié)線蟲1858SRRNA基因轉(zhuǎn)錄間區(qū)序列，研究設(shè)計(jì)和驗(yàn)證了一種最大增長(zhǎng)率MAXRATIOMR定量方法，并進(jìn)行了特異性CT值定量方法的實(shí)驗(yàn)作為對(duì)照。結(jié)果表明，以MR方法進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算測(cè)定的線蟲數(shù)量比CT值定量方法更接近真實(shí)值。以上三種檢測(cè)及定量技術(shù)在檢測(cè)的效率、靈敏度以及準(zhǔn)確度等諸多方面進(jìn)行了創(chuàng)新，適合在相應(yīng)領(lǐng)域應(yīng)用推廣。