簡(jiǎn)介：登革病毒（DENGUEVIRUS屬于黃病毒科黃病毒屬，是一種單股正鏈的RNA病毒，全長(zhǎng)約11KB，含有一個(gè)單一的開(kāi)放讀碼框，開(kāi)放讀碼框可依次編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白（C、PRM和E）和7種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5）。結(jié)構(gòu)蛋白主要參與病毒與宿主細(xì)胞的吸附及病毒顆粒的組裝；其中E蛋白是對(duì)病毒感染起保護(hù)性免疫作用的抗原。非結(jié)構(gòu)蛋白則主要在病毒基因組的復(fù)制和翻譯過(guò)程中發(fā)揮重要作用1。登革病毒（DENGUEVIRUS，DEN）包括4個(gè)血清型（DENV1型，DENV2型，DENV3型，DENV4型），其引起的登革熱是世界上分布最廣、發(fā)病人數(shù)最多、危害最嚴(yán)重的蚊媒疾病，廣泛流行于全球100多個(gè)國(guó)家2。由其感染所引起的疾病包括無(wú)癥狀感染、一般性發(fā)熱、溫和的登革熱（DENGUEFEVER，DF）以及嚴(yán)重的登革出血熱（DENGUEHEMRHAGICFEVER，DHF）和登革休克綜合征（DENGUESHOCKSYNDROME，DSS）3。接種疫苗是控制登革熱最重要的手段。由于抗體依賴增強(qiáng)感染效應(yīng)ANTIBODYDEPENDENTENHANCEMENTADE，理想的登革疫苗應(yīng)該是能夠誘導(dǎo)人體產(chǎn)生4種血清型DENV均有免疫保護(hù)作用46。進(jìn)展最快的登革疫苗是法國(guó)賽諾菲巴斯德公司的登革四價(jià)減毒活疫苗（CYDTDV），該疫苗已經(jīng)完成三期臨床試驗(yàn)，于2016年1月份在墨西哥率先上市臨床數(shù)據(jù)顯示，該疫苗抵抗DENV1、DENV3、DENV4的有效率分別為503％、740、777，但抗DENV2的有效率只有42378。該嵌合疫苗是以黃病毒家族（YF17D）毒株骨架，再以4個(gè)血清型DENV病毒的同源序列（PRME）替換骨架病毒的相應(yīng)基因得到的重組嵌合毒株，從而獲得合適的減毒效率和較強(qiáng)的免疫原性910。我國(guó)研制的乙腦減毒活疫苗SA14142于1989年在中國(guó)被批準(zhǔn)上市，目前為止，已經(jīng)有超過(guò)3億兒童接種疫苗。研究顯示，該疫苗株具有良好的減毒特性和安全性，單次免疫能有效誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性的中和抗體，而且免疫力持久1113。由于黃病毒的基因機(jī)構(gòu)、復(fù)制翻譯策略都非常相似，可以用分子生物學(xué)的方法相互改變黃病毒的基因，以構(gòu)建新的嵌合病毒1416。李曉峰等17將DENV2的PREME蛋白基因成功插入SA14142為骨架中，構(gòu)建了CHINDENV2型嵌合疫苗，該嵌合病毒在小鼠和靈長(zhǎng)類動(dòng)物上具有減毒效果。本研究擬以乙腦減毒活疫苗SA14142為骨架，將登革4型病毒PREME蛋白編碼基因替換進(jìn)SA14142基因中，繼續(xù)構(gòu)建DENV4型嵌合疫苗，初步完成乙腦登革4型嵌合病毒的構(gòu)建與生物學(xué)性質(zhì)評(píng)價(jià)。本研究包括以下兩個(gè)部分一、乙腦登革4型嵌合病毒的構(gòu)建。嵌合病毒是利用反向遺傳學(xué)的方法，由結(jié)構(gòu)功能相似的同源或者異源病毒相互替換部分結(jié)構(gòu)基因而獲得的一種新的病毒，為了保證重組病毒的安全性，我們一般采用已知特性的病毒株，一般多選用減毒株作為病毒載體。本研究利用乙腦減毒活疫苗SA14142為骨架，我們采用分子生物學(xué)的方法將疫苗株的PRM和E蛋白編碼基因替換為登革4型病毒（DENV4GZ30）的PRM和E蛋白的相應(yīng)部分，構(gòu)成一種新的嵌合質(zhì)粒，命名為PCHINDENV4。通過(guò)酶切圖譜初步確定嵌合質(zhì)粒的大小和完整性進(jìn)一步測(cè)定質(zhì)粒的全基因序列運(yùn)用DNASTAR軟件比對(duì)嵌合質(zhì)粒與病毒基因序列的差異。利用體外轉(zhuǎn)錄的方法，將嵌合質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄成RNA，并且轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞，約3天后細(xì)胞出現(xiàn)典型病變后，得到嵌合病毒。通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR實(shí)驗(yàn)判斷病毒是否正確。測(cè)病毒CDNA序列，比對(duì)是否與原質(zhì)粒序列相同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，我們能通過(guò)反向遺傳學(xué)的方法成功拯救出乙腦登革4型嵌合病毒。嵌合病毒能夠在BHK21細(xì)胞上復(fù)制。二、乙腦登革4型嵌合病毒生物學(xué)特性評(píng)價(jià)。我們對(duì)嵌合病毒與其親本病毒在不同細(xì)胞系中的生長(zhǎng)特性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與親本病毒株相比無(wú)顯著差異。進(jìn)一步對(duì)嵌合病毒的蝕斑特征及在動(dòng)物體內(nèi)的神經(jīng)毒力和神經(jīng)侵襲力進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示嵌合病毒的蝕斑大小介于兩親本株之間，其神經(jīng)毒力和神經(jīng)侵襲力與親本株弱。綜上，本研究采用反向遺傳學(xué)的方法，構(gòu)建了一種新的登革乙腦嵌合病毒，通過(guò)將嵌合病毒與其親本病毒株生物學(xué)特性鑒定和比較，我們發(fā)現(xiàn)嵌合病毒在細(xì)胞上的復(fù)制生長(zhǎng)能力沒(méi)有降低，但毒力較其親本病毒株減弱，乙型登革病毒反向遺傳學(xué)系統(tǒng)的建立為基因乙腦疫苗株骨架的新型登革病毒四價(jià)疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

簡(jiǎn)介：廣西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文1不同劑量和時(shí)間分割電離輻射誘導(dǎo)的不同劑量和時(shí)間分割電離輻射誘導(dǎo)的P53脈沖脈沖動(dòng)力學(xué)特征及其生物學(xué)效應(yīng)研究動(dòng)力學(xué)特征及其生物學(xué)效應(yīng)研究導(dǎo)師姓名導(dǎo)師姓名王衛(wèi)東王衛(wèi)東專業(yè)名稱專業(yè)名稱腫瘤學(xué)腫瘤學(xué)申請(qǐng)學(xué)位類型申請(qǐng)學(xué)位類型專業(yè)學(xué)位專業(yè)學(xué)位答辯委員會(huì)主席答辯委員會(huì)主席朱小東朱小東答辯委員會(huì)委員答辯委員會(huì)委員李力王晉川王晉川王春婷王春婷黃建鳴黃建鳴二○一六一六年五月年五月碩士學(xué)位論文不同劑量和時(shí)間分割電離輻射誘導(dǎo)的P53脈沖動(dòng)力學(xué)特征及其生物學(xué)效應(yīng)研究20132079520132079520162016廣西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文3個(gè)人簡(jiǎn)歷個(gè)人簡(jiǎn)歷基本情況基本情況姓名曹志性別男民族漢出生年月19876籍貫?zāi)铣涫信畎部h政治面貌共青團(tuán)員學(xué)習(xí)工作經(jīng)歷學(xué)習(xí)工作經(jīng)歷起止時(shí)間所在院?；騿挝粚W(xué)歷學(xué)位職稱2007920126瀘州醫(yī)學(xué)院本科學(xué)士無(wú)2012820139四川省腫瘤醫(yī)院本科學(xué)士初級(jí)2013920166廣西醫(yī)科大學(xué)研究生碩士初級(jí)研究生期間科研經(jīng)歷研究生期間科研經(jīng)歷臨床工作經(jīng)歷臨床工作經(jīng)歷項(xiàng)目起止時(shí)間項(xiàng)目名稱項(xiàng)目來(lái)源本人承擔(dān)任務(wù)無(wú)無(wú)無(wú)無(wú)起止時(shí)間單位職稱2014220166四川省腫瘤醫(yī)院初級(jí)

簡(jiǎn)介：目的研究認(rèn)為白血病患者體內(nèi)存在一群極微量的細(xì)胞群，這些細(xì)胞通常對(duì)化療藥物不敏感，能夠逃逸化學(xué)藥物的殺傷作用同時(shí)具有一定的自我更新能力使其可以在體內(nèi)維持白血病的生成，從而成為白血病復(fù)發(fā)和耐藥的根源。這群白血病細(xì)胞被稱為白血病干細(xì)胞LEUKEMIASTEMCELLS，LSCS。只有有效清除LSCS，才能從根本上治愈白血病。發(fā)現(xiàn)并研究LSCS上特異性表達(dá)的分子抗原，對(duì)LSCS的生物學(xué)特性研究以及白血病治療都具有重要意義。前期實(shí)驗(yàn)初步表明，本實(shí)驗(yàn)室自行研制的3A4單克隆抗體對(duì)急性髓系白血病干細(xì)胞（CD34CD38CD123）具有較強(qiáng)的識(shí)別能力。在此基礎(chǔ)上，我們對(duì)3A4單抗靶向的3A4抗原的生物學(xué)特性進(jìn)行全面和深入的分析，探討3A4抗原作為AMLLSCS靶點(diǎn)的可能性，為白血病靶向治療提供新的途徑。本課題進(jìn)行了如下四個(gè)部分內(nèi)容的研究13A4抗原表達(dá)規(guī)律的分析23A4抗原表位的研究33A4抗原相關(guān)干細(xì)胞特性的研究43A4高三尖杉酯堿抗體偶聯(lián)物的制備及其靶向殺傷活性檢測(cè)。方法13A4抗原表達(dá)規(guī)律的分析113A4及相關(guān)抗原在白血病干細(xì)胞及各亞群細(xì)胞上的表達(dá)1流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)3A4抗原、3A4的相關(guān)同型抗原（CD45RA、CD45和CD45RO）以及干祖細(xì)胞相關(guān)抗原CD33、CD44、CD123、CD133、CD19和HLADR在兒童白血病患者骨髓LSCS、正常造血干細(xì)胞HEMATOPOIETICSTEMCELLS，HSCS及各亞群細(xì)胞上的表達(dá)情況。其中ALL37例（31例BALL，6例TALL），AML54例（4例M0M1，14例M2，5例M3，29例M4M5，2例M6），CML6例。11例特發(fā)性血小板減少性紫癜IDIOPATHICTHROMBOCYTOPENICPURPURA，ITP患者作為對(duì)照。2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)3A4抗原及上述抗原在10例AML和10例BALL復(fù)發(fā)白血病患者骨髓白血病細(xì)胞上的表達(dá)。3細(xì)胞定義LSCS和HSCS以CD34CD38LIN細(xì)胞群定義，各亞群細(xì)胞分別指CD34、CD34CD38、CD34CD38和CD34CD38LIN細(xì)胞。123A4抗原在多器官正常組織和腫瘤組織的分布情況通過(guò)組織微陣列技術(shù)結(jié)合免疫組化法檢測(cè)3A4抗原在99例多器官正常組織和96例多器官腫瘤組織上的表達(dá)。23A4抗原表位的研究21CD45RC各截短型真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)根據(jù)CD45基因6號(hào)外顯子基因序列CD45RC構(gòu)建4個(gè)不同的截短型真核表達(dá)載體，分別命名為PCDNA31CD45RC1（包含6號(hào)外顯子前99BP）、PCDNA31CD45RC2（包含6號(hào)外顯子后99BP）、PCDNA31CD45RC3（包含6號(hào)外顯子前48BP）和PCDNA31CD45RC4（包含6號(hào)外顯子后48BP）將空載體PCDNA31、未截短型PCDNA31CD45RC以及構(gòu)建成功的上述4個(gè)截短型真核表達(dá)載體分別經(jīng)轉(zhuǎn)染級(jí)抽提試劑盒抽提質(zhì)粒后，經(jīng)LIPOFECTAMIM2000試劑盒采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將上述質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞通過(guò)RTPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后CHO細(xì)胞目的基因的表達(dá)采用流式細(xì)胞術(shù)和WESTERNBLOT檢測(cè)轉(zhuǎn)染后CHO細(xì)胞膜上的CD45RC各截短體蛋白的表達(dá)情況。22表位肽掃描法測(cè)定3A4抗原表位根據(jù)CD45基因6號(hào)外顯子編碼的氨基酸序列采用固相合成法合成一條多肽片段序列為DVPGERSTASTFPTDPVSPLTTTLSLAHHSSAALPARTSNTTITANTSD采用質(zhì)譜法MASSSPECTROMETRY，MS及高效液相色譜法HIGHPERFMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHY，HPLC檢測(cè)合成的多肽抗原的正確性及純度根據(jù)間接酶聯(lián)免疫吸附分析法INDIRECTENZYMELINKEDIMMUNOSBENTASSAY，IELISA分析該抗原多肽與3A4抗體的結(jié)合能力。33A4抗原相關(guān)干細(xì)胞特性研究31體外實(shí)驗(yàn)測(cè)定3A4抗原相關(guān)干細(xì)胞特性間接免疫磁珠法分選3A4陽(yáng)性和3A4陰性KASUMI細(xì)胞和HL60細(xì)胞BRDU滲入法標(biāo)記3A4陽(yáng)性和3A4陰性白血病細(xì)胞的增殖狀態(tài)CCK8法和ANNEXINⅤPI染色法檢測(cè)化療藥物作用下3A4陽(yáng)性和3A4陰性白血病細(xì)胞的增殖狀態(tài)和抗凋亡能力。32體內(nèi)實(shí)驗(yàn)測(cè)定3A4抗原相關(guān)干細(xì)胞特性通過(guò)3A4抗體封閉自血病細(xì)胞株（KG1A細(xì)胞和NALM6細(xì)胞）和人骨髓單個(gè)核細(xì)胞表面的3A4抗原，觀察經(jīng)過(guò)3A4抗體封閉和未封閉的兩群細(xì)胞在NODSCID小鼠體內(nèi)成瘤能力的差異通過(guò)間接免疫磁珠法分選3A4陽(yáng)性和3A4陰性的AML患者骨髓單個(gè)核白血病細(xì)胞，比較這兩群細(xì)胞在NODSCID小鼠異體移植成瘤能力的差異。43A4HHT抗體偶聯(lián)藥物的制備及靶向殺傷活性檢測(cè)413A4HHT抗體偶聯(lián)藥物的制備異型雙功能交聯(lián)劑（SPDP和SMCC）修飾3A4抗體的半胱氨酸CYSTEINE，CYS富含的巰基（SH）或賴氨酸LYSINE，LYS殘基富含的氨基（NH2）硫脲法將高三尖杉酯堿（HOMOHARRINGTONINE，HHT）的末端羥基（OH）巰基化修飾后的3A4抗體與巰基化HHT4℃過(guò)夜結(jié)合反應(yīng)BCA測(cè)定3A4HHT偶聯(lián)藥物蛋白濃度流式細(xì)胞儀測(cè)定3A4HHT偶聯(lián)藥物的活性。423A4HHT抗體偶聯(lián)藥物靶向殺傷活性檢測(cè)采用CCK8細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)不同濃度0、1、2、4、8、16、32ΜGML3A4HHT抗體偶聯(lián)藥物在不同作用時(shí)間（24H、48H和72H）下對(duì)KG1A細(xì)胞和NALM6細(xì)胞的靶向殺傷活性。結(jié)果13A4抗原表達(dá)規(guī)律的分析113A4及相關(guān)抗原在白血病干細(xì)胞及各亞群細(xì)胞上的表達(dá)13A4抗原在AMLLSCS上的表達(dá)水平明顯高于HSCS，中位表達(dá)水平分別為948％VS218％，P＜00001且3A4抗原在54例AML患者的LSCS上均為陽(yáng)性表達(dá)。23A4抗原在AML和BALL復(fù)發(fā)白血病患者的白血病細(xì)胞上具有較強(qiáng)的表達(dá)，中位表達(dá)水平分別為（909±49）％和（817±91）％。33A4抗原在各亞型AMLLSCS上的表達(dá)水平分別為（923±33）％M01、（951±15）％M2、（464±138）％M3、85243％M45和（612±289）％M6，以M01和M2型白血病上的抗原表達(dá)水平最高。43A4抗原在正常CD34CD38細(xì)胞上較其他細(xì)胞亞群CD34CD38和CD34CD38LIN相對(duì)高表達(dá)，而在AMLCD34CD38、CD34CD38和CD34CD38LIN各細(xì)胞群上的表達(dá)無(wú)明顯差異。53A4抗原在AMLLSCS和HSCS上的表達(dá)選擇性明顯高于CD33、CD123、CD133、CD44和HLADR抗原。123A4抗原在多器官正常組織和腫瘤組織器官的分布情況13A4抗原主要在脾臟、扁桃體和胸腺等淋巴組織器官上表達(dá)，在甲狀旁腺、小腸、結(jié)腸、胃等組織上主要限制表達(dá)于淋巴組織處，在重要器官組織（如腦、心、肝、肺、腎、生殖器官）上基本不表達(dá)。23A4抗原主要在腸、脾、甲狀腺、淋巴結(jié)等淋巴組織處發(fā)生的B細(xì)胞性淋巴瘤、B細(xì)胞性細(xì)胞瘤、何杰金氏淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤上高表達(dá)，在T細(xì)胞性淋巴瘤上基本不表達(dá)。23A4抗原表位的研究21CD45RC各截短型真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)1真核表達(dá)載體PCDNA31CD45RC1、PCDNA31CD45RC2、PCDNA31CD45RC3和PCDNA31CD45RC4經(jīng)搖菌擴(kuò)增提取質(zhì)粒DNA后，酶切及測(cè)序結(jié)果顯示構(gòu)建的載體分別包含相應(yīng)的目的基因片段，表明CD45RC的4個(gè)截短型真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。2RTPCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后的各截短型CD45RCCHO細(xì)胞中存在CD45基因表達(dá)，表明各轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄水平上成功表達(dá)CD45基因，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞分別命名為CD45RC1CHO、CD45RC2CHO、CD45RC3CHO和CD45RC4CHO。3流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4個(gè)截短型CD45RCCHO細(xì)胞均可檢測(cè)到3A4抗原的表達(dá)，表達(dá)水平分別為（367±69）％、（352±133）％、（43±79）％和（414±142）％，各組間均無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P值均＞005）。而WESTERNBLOT法在CD45RC1CHO、CD45RC2CHO、CD45RC3CHO和CD45RC4CHO細(xì)胞上未能檢測(cè)到3A4抗體識(shí)別的抗原。22表位肽掃描法測(cè)定3A4抗原表位MS結(jié)果顯示合成的多肽抗原分子量為49965，與理論分子量499635相近，從分子量水平上提示多肽合成正確HPLC檢測(cè)結(jié)果顯示，合成的多肽抗原純度為70％左右，符合下一步實(shí)驗(yàn)要求IELISA結(jié)果顯示，3A4抗體不能識(shí)別CD45基因6號(hào)外顯子編碼的氨基酸線性序列，提示3A4抗原表位可能為構(gòu)象型表位。33A4抗原相關(guān)干細(xì)胞特性研究31體外實(shí)驗(yàn)測(cè)定3A4抗原相關(guān)干細(xì)胞特性3A4陽(yáng)性KASUMI細(xì)胞和HL60細(xì)胞的增殖能力分別低于相應(yīng)3A4陰性KASUMI細(xì)胞和HL60細(xì)胞的增殖能力，BRDU的表達(dá)水平分別為（46±19）％VS（351±1）％，P＜005和（449±13）％VS（744±2）％，P＜005IC50和IC70作用濃度下的THP和ARAC對(duì)3A4陽(yáng)性KASUMI細(xì)胞和HL60細(xì)胞的抑制率均低于相應(yīng)3A4陰性細(xì)胞（P值均＜005），而IC50和IC70濃度下的HHT對(duì)這兩群細(xì)胞的抑制率均無(wú)明顯差異（P值均＞005）在THP和ARAC作用下，3A4陽(yáng)性KASUMI細(xì)胞和HL60細(xì)胞的抗凋亡能力均高于相應(yīng)的3A4陰性白血病細(xì)胞，而在HHT作用下兩者的抗凋亡能力無(wú)明顯差異。32體內(nèi)實(shí)驗(yàn)測(cè)定3A4抗原相關(guān)干細(xì)胞特性經(jīng)尾靜脈注射5106個(gè)NALM6細(xì)胞后，3A4抗體孵育組小鼠和鼠IGG抗體孵育組小鼠在植入15天以后，均開(kāi)始出現(xiàn)行動(dòng)遲緩，消瘦、后肢癱瘓或弓背等情況，流式和病理結(jié)果顯示小鼠體內(nèi)存在白血病細(xì)胞浸潤(rùn)，中位發(fā)病時(shí)間分別為18和22天。經(jīng)尾靜脈注射5106個(gè)KG1A細(xì)胞后，鼠IGG抗體孵育組小鼠均生成白血病，成瘤率為100％33，中位發(fā)病時(shí)間為58天3A4抗體孵育組小鼠生存狀態(tài)良好。43A4HHT抗體偶聯(lián)藥物的制備及靶向殺傷活性檢測(cè)BCA測(cè)定3A4SPDPHHT和3A4SMCCHHT偶聯(lián)物的蛋白濃度分別為02MGML和03MGML流式結(jié)果顯示3A4SPDPHHT和3A4SMCCHHT對(duì)KG1A細(xì)胞的識(shí)別能力與裸抗3A4無(wú)明顯差異，分別為9889％和9468％CCK8結(jié)果顯示，在不同觀察時(shí)間和藥物濃度作用下，3A4SPDPHHT和3A4SMCCHHT對(duì)NALM6細(xì)胞的抑制率均明顯低于KG1A細(xì)胞（P值均＜005），說(shuō)明3A4SPDPHHT和3A4SMCCHHT對(duì)靶細(xì)胞KG1A具有良好的選擇性殺傷作用。其中，3A4SPDPHHT和3A4SMCCHHT隨著作用濃度增加，對(duì)細(xì)胞的抑制作用亦逐漸增強(qiáng)，但不呈時(shí)間依賴性。結(jié)論13A4抗原選擇性地高表達(dá)于AMLLSCS，以M01和M2類型白血病最為明顯，而在正常HSCS上弱表達(dá)。3A4抗原在AMLLSCS和HSCS上的表達(dá)選擇性明顯高于CD33、CD123、CD133和CD44等抗原分子。此外在復(fù)發(fā)AML患者的骨髓白血病幼稚細(xì)胞上同樣具有較強(qiáng)的表達(dá)水平。23A4抗原主要在淋巴相關(guān)組織器官及淋巴細(xì)胞上表達(dá)，在重要器官組織（如腦、心、肝、肺、腎和生殖器官等）上基本不表達(dá)。33A4抗原表位主要為CD45基因6號(hào)外顯子編碼的蛋白區(qū)域，可能是構(gòu)象型表位。43A4抗原陽(yáng)性的HL60細(xì)胞和KASUMI細(xì)胞較相應(yīng)的3A4陰性細(xì)胞耐藥及抗凋亡能力更強(qiáng)，一定程度上反映了3A4陽(yáng)性白血病干細(xì)胞的特性。53A4抗體可以有效抑制KG1A細(xì)胞在NODSCID小鼠體內(nèi)成瘤。6成功制備3A4SMCCHHT和3A4SPDPHHT抗體偶聯(lián)物，體外顯示良好的靶向殺傷效應(yīng)。

簡(jiǎn)介：目的骨具有修復(fù)再生的獨(dú)特能力，這歸于一系列控制骨愈合的細(xì)胞和分子參與了這個(gè)復(fù)雜的過(guò)程并調(diào)控骨骼的生長(zhǎng)和發(fā)育。骨修復(fù)中的一個(gè)重要組成部分就是骨細(xì)胞的行為。骨這種本身存在的緊密耦合對(duì)骨骼系統(tǒng)的正常功能及維持至關(guān)重要。骨骼系統(tǒng)的主要功能包括1提供對(duì)器官組織的支持2調(diào)節(jié)造血系統(tǒng)。骨的改建與重構(gòu)過(guò)程主要由兩個(gè)主要類型的細(xì)胞即成骨細(xì)胞所帶來(lái)的骨形成和破骨細(xì)胞造成的骨降解而完成的。這個(gè)過(guò)程正是由這些細(xì)胞的發(fā)展和激活所緊密調(diào)節(jié)的當(dāng)然，也是由一個(gè)復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)通路所參與介導(dǎo)的。目前，已經(jīng)被證明ERK通路、OPGRANKL通路、BMP2SMADS通路和WNT信號(hào)等多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在整個(gè)成骨細(xì)胞分化增殖過(guò)程中都起著重要的作用。但由于這個(gè)過(guò)程本身較為復(fù)雜，所以具體的調(diào)控機(jī)制還不是十分明確。近年來(lái)在骨代謝方面，尤其是神經(jīng)分泌的神經(jīng)遞質(zhì)信號(hào)對(duì)成骨細(xì)胞的影響成為了研究熱點(diǎn)，這為研究骨的生長(zhǎng)發(fā)育、修復(fù)、以及相關(guān)疾病的治療帶來(lái)了新的方向。CGRP受體屬于G蛋白偶聯(lián)家族成員，是由七個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域蛋白即降鈣素受體樣受體CRLR和輔助蛋白，受體活性修飾蛋白（RAMP1）。此外，CGRP受體組分蛋白R(shí)CP作為胞漿蛋白，似乎是有效的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所需要的信號(hào)。而CGRP正是能激活這種受體相關(guān)的異三聚體的蛋白。進(jìn)一步的證據(jù)表明CGRP在骨中起著重要作用能影響成、破骨細(xì)胞的功能。體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)基因小鼠成骨細(xì)胞過(guò)表達(dá)CGRP能夠使骨密度增加。此外，在各種成骨細(xì)胞系及正常人成骨細(xì)胞樣細(xì)胞上均發(fā)現(xiàn)CT和CGRP及其受體的MRNA的表達(dá)。CGRP還能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖以及胰島素生長(zhǎng)因子IGF的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，CGRP能通過(guò)其受體受體刺激CAMP活性和磷脂酶分別刺激活化蛋白激酶APKA，并增加細(xì)胞內(nèi)游離鈣的水平以及蛋白激酶CPKC激活。此次研究首先關(guān)注了CGRP受體所介導(dǎo)的誘導(dǎo)成骨分化的功能，明確CGRP在促進(jìn)骨修復(fù)中的涉及的相關(guān)機(jī)制，同時(shí)也初步探索了在炎癥性骨疾病中CGRP潛在的保護(hù)作用，以期為CGRP的在骨創(chuàng)傷愈合中的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。在研究CGRP受體所介導(dǎo)的誘導(dǎo)成骨分化的功能的試驗(yàn)中，首先利用慢病毒載體的構(gòu)建，穩(wěn)定敲除了CGRP受體RAMP1的表達(dá)，熒光定量PCR，WB，以及免疫熒光檢測(cè)敲除RAMP1后對(duì)CGRP受體表達(dá)的影響。又通過(guò)細(xì)胞增殖測(cè)定，骨分化標(biāo)志基因的表達(dá)的檢測(cè)和茜素紅染色等方法，檢測(cè)了敲除RAMP1后對(duì)CGRP誘導(dǎo)成骨細(xì)胞活性和分化的影響。結(jié)果表明，在成骨細(xì)胞中敲除RAMP1會(huì)導(dǎo)致CRLR表達(dá)和在細(xì)胞膜分布的抑制。此外，RAMP1的穩(wěn)定敲除會(huì)抑制CGRP誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和堿性磷酸酶活性，會(huì)減少RUNX2和Ⅰ型膠原的MRNA的表達(dá)以及礦化沉積。還發(fā)現(xiàn)，敲除RAMP1會(huì)抑制CGRP刺激的成骨細(xì)胞CAMP的水平。此外，在本次實(shí)驗(yàn)中，還首次探討了CGRP對(duì)于LPS誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡的影響。同時(shí)，也在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中對(duì)此進(jìn)行了驗(yàn)證，并探討CGRP在LPS誘導(dǎo)的大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型牙周組織中的作用及相關(guān)機(jī)制。方法實(shí)驗(yàn)一1用不同濃度的CGRP處理MG63細(xì)胞1，4，7天后，采用CCK8法檢測(cè)CGRP對(duì)成骨細(xì)胞增殖活性的影響。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，CGRP能夠顯著增加成骨細(xì)胞的增殖活性，且最佳濃度在108M。此外，ALP活性也被檢測(cè)。不同劑量的CGRP處理MG63細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)1，4，7天，茜素紅進(jìn)行礦化結(jié)節(jié)的染色。2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染慢病毒以敲除RAMP1的表達(dá)，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞（CONSHRNA，SHRAMP1）的細(xì)胞用熒光定量PCR、WESTERNBLOT及免疫熒光染色檢測(cè)RAMP1其他CGRP受體的蛋白和基因水平表達(dá)變化和膜分布的變化。3CCK8法檢測(cè)CONSHRNA組，SHRAMP1處理組的細(xì)胞增殖活性。接下來(lái)，成骨細(xì)胞的分化也同樣用ALP檢測(cè)。QPCR檢測(cè)成骨細(xì)胞的分化標(biāo)志物RUNX2和COLLAGENⅠ表達(dá)。4轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞內(nèi)CAMP水平的變化被檢測(cè)。CCK8檢測(cè)加入CAMPPKA信號(hào)的激動(dòng)劑FSKOLIN后的CONSHRNA組、SHRAMP1處理的細(xì)胞的增殖活性。此外，還檢測(cè)了ALP活性以及RUNX2和COLLAGENIMRNA水平，最后進(jìn)行了各組的茜素紅染色。實(shí)驗(yàn)二5首先檢測(cè)了用不同濃度01000NGMLLPS作用于MC3T3E1細(xì)胞48H的細(xì)胞活性。同時(shí)，也檢測(cè)了CGRP的處理對(duì)MC3T3E1細(xì)胞活性的影響。6用或無(wú)100NMCGRP預(yù)處理MC3T3E1細(xì)胞30MIN，再用LPS處理48H，流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)了CGRP對(duì)LPS誘導(dǎo)的MC3T3E1細(xì)胞凋亡的影響。與此同時(shí)，還用WESTERNBLOT檢測(cè)了CGRP對(duì)LPS刺激的CASPASE3剪切蛋白表達(dá)的影響。7WESTERNBLOT檢測(cè)了CGRP對(duì)LPS刺激的ERK信號(hào)活化的影響8MICROCT掃描檢測(cè)牙周炎模型骨破壞程度，BVF值進(jìn)行定量分析骨吸收程度。HE染色檢測(cè)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)免疫組化染色檢測(cè)牙周組織細(xì)胞凋亡及CASPASE3剪切和ERK的表達(dá)?？偨Y(jié)1CGRP促進(jìn)成骨細(xì)胞的細(xì)胞活性和成骨分化能力。2RAMP1的表達(dá)可以抑制CRLR的表達(dá)。3敲除RAMP1抑制CGRP誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞的活性和成骨分化能力。4敲除RAMP1抑制CGRP調(diào)節(jié)的分化是通過(guò)CAMPPKA信號(hào)途徑。5CGRP顯著刺激增加成骨細(xì)胞的活力以劑量依賴的方式，具有最佳在10NM。CGRP可以緩解LPS對(duì)細(xì)胞活力的抑制且濃度為100NM，而不是10NM。6CGRP抑制LPS誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞的凋亡。7CGRP抑制LPS誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞PERK表達(dá)。8CGRP抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和牙周炎模型中的骨破壞。

簡(jiǎn)介：豬鏈球菌（STREPTOCOCCUSSUIS，SS）根據(jù)其英膜抗原CPS組分的不同，被分為35（1～34型，12型）種血清型，致病性血清型主要在1～9型，其中血清型2型SS2是致病力最強(qiáng)研究最多的豬鏈球菌。豬鏈球菌2型（STREPTOCOCCUSSUISTYPE2，SS2）是引起人畜共患急性、熱性傳染病的致病菌之一，在世界各地均有流行，曾在我國(guó)兩次較大規(guī)模爆發(fā)并引起人類感染死亡。近年來(lái)的研究主要集中在與致病性相關(guān)的毒力因子，如莢膜多糖CPS、溶菌酶釋放蛋白MRP、胞外因子EF、溶血素SLY、纖連結(jié)合蛋白FBPS，血清渾濁因子OFS，89KD毒力島等。目前國(guó)內(nèi)預(yù)防豬鏈球菌的疫苗有豬鏈球菌2型滅活疫苗和2型與C群二價(jià)滅活疫苗。但由于豬鏈球菌致病血清型較多，不同型之間交叉保護(hù)性未知或交叉保護(hù)性較差，難以有效控制豬鏈球菌病。此外，雖然國(guó)內(nèi)有基于MRP和莢膜抗原的豬鏈球菌2型抗體的ELISA檢測(cè)試劑盒，但非2型在豬群中的感染可能無(wú)法檢測(cè)到，因此也無(wú)法了解2型以外豬源鏈球菌的感染狀況。本研究旨在1篩選具有高黏附力和低致病性（或非致病性）的非2型豬鏈球菌作為疫苗候選菌株2分析抗SAO和DNAJ蛋白多抗與不同血清型鏈球菌的交叉反應(yīng)性3建立基于SAO蛋白的間接ELISA體系，檢測(cè)試驗(yàn)豬場(chǎng)健康豬群中豬鏈球菌抗體陽(yáng)性率，并與已有的SS2檢測(cè)試劑盒結(jié)果進(jìn)行比較。本實(shí)驗(yàn)在295份采集樣品中分離獲得66株非2型豬鏈球菌，通過(guò)細(xì)菌黏附試驗(yàn)篩選出8株黏附率顯著高于HA9801強(qiáng)毒株12％的菌株（5％27％）。經(jīng)血清型鑒定，SS281菌株為血清4型，HN152菌株為31型，其余6株無(wú)法確定血清型。經(jīng)測(cè)序分析，8株菌株與HA9801菌株16SRRNA基因序列同源性在973％～999％之間，進(jìn)化樹(shù)分析其中7株與HA9801菌株分屬同一群。各菌株鏈長(zhǎng)、生長(zhǎng)特性和主要毒力因子（MRPEPFF2SLYGAPDHFBPSEF）分布情況在菌株間存在差異。細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，8菌株細(xì)胞毒性均顯著低于HA9801強(qiáng)毒株小鼠毒力試驗(yàn)結(jié)果顯示，HN152菌株致死率顯著低于其他菌株（28％，感染劑量19108CFU鼠）。DNAK家族中的DNAJ蛋白是SS2重要的表面蛋白，也應(yīng)該保守存在于其它血清型SS。SAO蛋白也普遍存在于各血清型豬鏈球菌表面，序列分析結(jié)果表明，本試驗(yàn)涉及的不同SS菌株之間DNAJ和SAO基因之間的核苷酸同源性分別在87％100％和94％100％。應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的SS2的DNAJ和SAO高免血清，通過(guò)全菌ELISA、DOTELISA及免疫印跡方法分析不同血清型的交叉反應(yīng)性。結(jié)果表明，SS2DNAJ多抗與SS2、SS4、SS5、SS7、SS9、SS31等血清型交叉反應(yīng)性良好，而SAO多抗則只與SS2反應(yīng)。用原核表達(dá)DNAJ和SAO蛋白作為包被抗原建立了間接ELISA檢測(cè)體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DNAJ與SS2全菌多抗及SS感染陽(yáng)性血清反應(yīng)性差，無(wú)法建立ELISA體系，而SAO蛋白作為包被抗原的間接ELISA檢測(cè)體系成功優(yōu)化。應(yīng)用該ELISA檢測(cè)體系和商品化SS2檢測(cè)試劑盒對(duì)4個(gè)豬場(chǎng)的150份血清進(jìn)行抗體檢測(cè)，結(jié)果表明SAOELISA的豬鏈球菌抗體陽(yáng)性率高達(dá)53％，而基于CPS2ELISA的豬鏈球菌2型抗體陽(yáng)性率也高達(dá)47％。如果商品化試劑盒的結(jié)果可靠，那么這些豬場(chǎng)的SS2血清陽(yáng)性率很高，可能存在非2型鏈球菌的感染。綜合上述結(jié)果，雖然我們篩選到了黏附率相對(duì)較高的菌株，但是因?yàn)樵?08CFU接種水平對(duì)小鼠均有不同程度致病性（包括豬鏈球菌31型菌株HN152），難以作為弱毒疫苗候選株用于進(jìn)一步研究?；赟AO蛋白的間接ELISA方法對(duì)于監(jiān)測(cè)豬群中豬鏈球菌自然感染抗體水平或免疫抗體水平有一定的實(shí)用價(jià)值。

簡(jiǎn)介：第三軍醫(yī)大學(xué)研究生學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明秉承學(xué)校嚴(yán)謹(jǐn)?shù)男ｏL(fēng)和科研作風(fēng)，本人申明所里交的論文是我本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果，也不包含為獲得我?；蚱渌逃龣C(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書(shū)而使用過(guò)的材料，與我同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示謝意。申請(qǐng)學(xué)位論文與資料若有不實(shí)之處，本人承擔(dān)一切相關(guān)責(zé)任。論文作者簽名壘堡日期第三軍醫(yī)大學(xué)研究生學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū)本人完全了解第三軍醫(yī)大學(xué)有關(guān)保護(hù)知識(shí)產(chǎn)權(quán)的規(guī)定，即研究生在攻讀學(xué)位期間論文工作的知識(shí)產(chǎn)權(quán)單位屬第三軍醫(yī)大學(xué)。本人保證畢業(yè)離校后，發(fā)表論文或使用論文工作成果時(shí)署名單位為第三軍醫(yī)大學(xué)。學(xué)校有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤(pán)，允許論文被查閱和借閱。學(xué)?？梢怨紝W(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容保密內(nèi)容除外，可以采用影印、縮印或其他手段保存論文。論文作者簽名指導(dǎo)教師簽名日期第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文英文縮寫(xiě)AMDBFGFBSACRALBPDAPIDIIDMEMEBSFBSFITCFERGGCLGAPDHHESCSRNLONLPAX6PBSPFAPOSRP縮略語(yǔ)表英文全稱中文名稱RETINALPIGMENTEDEPITHELIAL年齡相關(guān)性黃斑變性BASICFIBROBLASTGROWTHFACTOR基本的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子ALBUMINFROMBOVINESERUM牛血清白蛋白CELLULARRETINALDEHYDEBINDINGPROTEIN細(xì)胞視黃醛結(jié)合蛋白4’，6DIAMIDINO2PHENYLINDOLE2HCI4。，6二脒基一2一苯吲哚鹽酸1，L’一DIOCTADECYL一3，3，3’，3’TETRAL，1’雙十八烷一3，3，3’，3’一四甲METHYLINDOCARBOCYANINEPERCHLORATE基吲哚羰花青一高氯酸鹽DULBECCO’SMODIFIEDEAGLE’SMEDIUMDMEM培養(yǎng)基EMBRYOIDBODIES，擬胚體FETALBOVINESERUM胎牛血清FLUORESCEINISOTHIOCYANATE異硫氰酸熒光素FLASHELECTRORETINOGRAM閃爍視網(wǎng)膜電圖GANGLIONCELLLAYER神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層GLYCERALDEHYDE3PHOSPHATEDEHYDROGENASE3一磷酸甘油醛脫氫酶HUMANEMBRYONICSTEMCELLS人胚胎干細(xì)胞INNERNUCLEARLAYER內(nèi)核層OUTERNUCLEARLAYER外核層PAIREDBOXGENE6配對(duì)基因盒6PHOSPHATEBUFFEREDSALINE磷酸鹽緩沖溶液PARAFORMALDEHYED多聚甲醛PHOTORECEPTOROUTERSEGMENT感光細(xì)胞外節(jié)RETINKISPIGMENTOSA視網(wǎng)膜色素變性

簡(jiǎn)介：點(diǎn)擊查看更多匹伐他汀納米顆粒改善內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)功能及修復(fù)損傷血管研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡(jiǎn)介：極低頻電磁場(chǎng)（EXTREMELYLOWFREQUENCYELECTROMAGICFIELDS，ELFEMF）一般指頻率為0300HZ的交變電磁場(chǎng)，其中頻率為5060HZ的磁場(chǎng)又稱為工頻磁場(chǎng)（MAGICFIELDS，MF），可由各種家用電器以及高壓輸變電線路產(chǎn)生，廣泛存在于職業(yè)環(huán)境及日常生活環(huán)境中。自1979年，LEEPER和WERTHEIMER首先報(bào)道MF暴露與兒童白血病發(fā)病率存在正相關(guān)，ELFEMF對(duì)人體的潛在危害日益受到人們的關(guān)注。此后，又有諸多研究報(bào)道ELFEMF暴露與腫瘤，神經(jīng)系統(tǒng)疾病，不孕癥等疾病具有相關(guān)性。然而，到目前為止，ELFEMF產(chǎn)生這些生物學(xué)效應(yīng)的機(jī)制尚不明確。線粒體作為細(xì)胞的“能量工廠”，不僅能夠通過(guò)呼吸作用產(chǎn)生ROS，還能在維持離子濃度平衡中起著重要的作用。因此，線粒體極易成為外界刺激因素的一個(gè)作用位點(diǎn)。本課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，工頻磁場(chǎng)暴露可以引起線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換（MITOCHONDRIALPERMEABILITYTRANSITION，MPT）并伴隨細(xì)胞色素CCYTC的釋放，但并不引起細(xì)胞發(fā)生凋亡。線粒體具有雙層膜結(jié)構(gòu)，正常生理情況下，線粒體內(nèi)膜對(duì)離子高度不通透。然而在某些因素的作用下，可致線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔MITOCHONDRIALPERMEABILITYTRANSITIONPE，MPTP開(kāi)啟，從而允許分子量小于1500DA的分子自由出入線粒體內(nèi)外膜，引起線粒體基質(zhì)腫脹及其結(jié)構(gòu)改變，并最終產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)。有研究表明，細(xì)胞內(nèi)有多種信號(hào)分子可介導(dǎo)MPTP的開(kāi)啟，從而誘導(dǎo)發(fā)生MPT，如BCL2蛋白家族，GSK3Β蛋白，ROS等，而誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS是工頻磁場(chǎng)比較確定的效應(yīng)。因此，本學(xué)位論文首先探索了ROS等信號(hào)分子在工頻磁場(chǎng)暴露誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生MPT過(guò)程中的可能作用，以期揭示工頻磁場(chǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞MPT的分子機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，工頻磁場(chǎng)暴露并不改變線粒體中BCL2，BAX蛋白的含量，但可以顯著增高細(xì)胞內(nèi)ROS水平并改變GSK3Β磷酸化水平程度用ROS清除劑NAC及GSK3Β抑制劑分別預(yù)處理細(xì)胞均可以抑制工頻磁場(chǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的MPT并且NAC預(yù)處理細(xì)胞能夠顯著抑制工頻磁場(chǎng)暴露后GSK3Β磷酸化的改變。以上結(jié)果提示，工頻磁場(chǎng)暴露引起細(xì)胞發(fā)生MPT由ROSGSK3Β信號(hào)通路介導(dǎo)。另外，前期研究發(fā)現(xiàn)工頻磁場(chǎng)暴露雖然誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生了MPT及CYTC的釋放，但并沒(méi)有引起細(xì)胞凋亡的發(fā)生，因此，推測(cè)工頻磁場(chǎng)暴露可能會(huì)改變細(xì)胞的狀態(tài)，從而影響細(xì)胞對(duì)外界刺激因素的響應(yīng)。為此，本學(xué)位論文隨后探索了工頻磁場(chǎng)暴露與凋亡誘導(dǎo)劑STAUROSPINESTS可能的聯(lián)合作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將細(xì)胞預(yù)暴露于工頻磁場(chǎng)可以顯著抑制低劑量STS誘導(dǎo)的細(xì)胞早期凋亡，并呈現(xiàn)出暴露時(shí)間窗效應(yīng)和功率窗效應(yīng)。MPT抑制劑CYCLOSPINEACSA預(yù)處理細(xì)胞可以抑制工頻磁場(chǎng)的抗凋亡作用，提示MPT在這一過(guò)程中起著重要的作用。同時(shí)，工頻磁場(chǎng)暴露可促進(jìn)線粒體ROS通過(guò)MPTP釋放到胞漿中并激活A(yù)KT信號(hào)通路。而且，PI3KAKT抑制劑能有效抑制MF的抗凋亡作用，提示AKT也參與了工頻磁場(chǎng)的抗凋亡過(guò)程。以上結(jié)果表明，工頻磁場(chǎng)暴露可誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體內(nèi)ROS經(jīng)MPTP釋放到胞漿并激活A(yù)KT信號(hào)通路，從而影響細(xì)胞對(duì)外界的刺激因素的響應(yīng)。綜上所述，本學(xué)位論文分別探討了工頻磁場(chǎng)暴露引起MPT的分子機(jī)制及其生物學(xué)效應(yīng)。結(jié)果顯示，細(xì)胞內(nèi)ROSGSK3Β信號(hào)通路介導(dǎo)工頻磁場(chǎng)誘導(dǎo)的MPT發(fā)生過(guò)程線粒體內(nèi)ROS可通過(guò)MPTP釋放到胞漿中并激活A(yù)KT信號(hào)通路，從而拮抗STS誘導(dǎo)的細(xì)胞早期凋亡。

簡(jiǎn)介：腫瘤是21世紀(jì)致死率最高的疾病之一。傳統(tǒng)腫瘤涉及的化學(xué)藥物、放射等療法給患者帶來(lái)嚴(yán)重的毒副作用。隨著納米生物醫(yī)藥學(xué)的快速發(fā)展，智能響應(yīng)性納米藥物遞送系統(tǒng)為解決上述問(wèn)題提供了突破口。中空納米介孔硅顆粒由于其生物相容性良好、均一可調(diào)的尺寸和介孔孔徑、高比表面積和孔容積、表面易于功能化修飾等特性，而被廣泛用作智能藥物遞送系統(tǒng)的載體。本文設(shè)計(jì)并構(gòu)建了一種以細(xì)胞色素C為封堵劑，二硫鍵和硼酸酯鍵為化學(xué)鏈接，乳糖酸為靶向分子，中空納米介孔硅為藥物載體的還原PH雙響應(yīng)性藥物遞送系統(tǒng)（HMSNSSSCPACYTCLA）。掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡、傅里葉變換紅外線光譜分析、熱重分析、ZETA電位分析、動(dòng)態(tài)光散射分析、比表面積和孔隙度分析等結(jié)果表明在中空納米介孔硅表面已經(jīng)成功接枝二硫鍵和硼酸酯鍵，并被乳糖酸修飾的細(xì)胞色素C封堵，即HMSNSSSCPACYTCLA藥物遞送系統(tǒng)成功構(gòu)建。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HMSNSSSCPACYTCLADOX具有還原和PH雙重刺激響應(yīng)性釋藥特性。所構(gòu)建的中空硅納米藥物遞送系統(tǒng)具有很好的細(xì)胞相容性，且HMSNSSSCPACYTCLADOX對(duì)HEPG2細(xì)胞有很好的抑制殺傷效果。透射電鏡、流式細(xì)胞分析術(shù)和激光共聚焦顯微觀察表明，HMSNSSSCPACYTCLADOX系統(tǒng)能夠被HEPG2細(xì)胞特異性靶向識(shí)別胞吞，且主要分布于細(xì)胞質(zhì)中；進(jìn)而被腫瘤細(xì)胞中特殊的微環(huán)境（大量GSH表達(dá)和酸性條件）刺激二硫鍵和硼酸酯鍵斷裂，釋放出裝載的抗癌藥物（DOX），抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)；同時(shí)，細(xì)胞質(zhì)中游離的CYTC在DATP存在的條件下可激活凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，協(xié)同介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。體內(nèi)腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HMSNSSSCPACYTCLADOX系統(tǒng)能夠有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤的生長(zhǎng)。腫瘤原位組織TUNEL細(xì)胞凋亡分析和主要臟器HE染色分析結(jié)果表明，相對(duì)于單純的DOX和HMSNSDOX，HMSNSSSCPACYTCLADOX系統(tǒng)對(duì)腫瘤組織有更好的抑制效果，且具有相對(duì)較低的毒副作用。本文構(gòu)建的雙響應(yīng)性納米藥物遞送系統(tǒng)在一定程度上提高了藥物的利用效率；同時(shí)，游離于細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞色素C可激活凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，協(xié)同介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究為腫瘤的雙重響應(yīng)性協(xié)同療法提供了新思路。

簡(jiǎn)介：乙?；D(zhuǎn)移酶抑制劑C646對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及作用機(jī)制研究⑧論文作者簽名≥垂檻指導(dǎo)教師簽名論文評(píng)閱人1匿名評(píng)閱評(píng)閱人2匿名遷闥評(píng)閱人3匿名遷闥評(píng)閱人4評(píng)閱人5答辯委員會(huì)主席睦蟹3熬拯3逝洹太堂醫(yī)堂睦委員1堂童∑熬拯∑逝江笪醫(yī)堂壁堂睦委員2奎國(guó)熊3圭堡醫(yī)短3煎趟垣菹太堂瞪屬醫(yī)瞳委員3睦鲞睦圭堡醫(yī)垣逝洹太堂醫(yī)堂瞳隨屬筻二醫(yī)院委員4廛塑齷3數(shù)援∑逝塑太堂醫(yī)堂醫(yī)隨厘筮二醫(yī)睦委員5答辯日期2016年5月30日本研究受浙江省省部共建項(xiàng)目計(jì)劃ETVL在胃腸道間質(zhì)瘤KITLOW干細(xì)胞致瘤分化中的調(diào)控機(jī)制研究項(xiàng)目編號(hào)WKJ20112002和P300／CBP在胃腸道間質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及調(diào)控機(jī)制項(xiàng)目編號(hào)WKJZJ一1614資助。

簡(jiǎn)介：多孔陽(yáng)極氧化鋁POUSANODICALUMINAPAA是通過(guò)電化學(xué)氧化的方法在純鋁表面形成的具有高度規(guī)整孔結(jié)構(gòu)的薄膜，其長(zhǎng)程有序的納米孔陣列結(jié)構(gòu)具有較好的化學(xué)穩(wěn)定性，優(yōu)異的耐磨防蝕性能，植入體內(nèi)后具有良好的生物安全性、無(wú)毒副作用，因此可以將其應(yīng)用在生物材料領(lǐng)域。其表面相互平行的大面積六角形排列的納米孔道可以作為生物活性物質(zhì)的優(yōu)良載體，從而賦予納米結(jié)構(gòu)本身特殊的生物學(xué)功能。近年來(lái)眾多的研究表明，鈣硅基CAOSIO2生物材料具有優(yōu)良的生物活性和降解性，能在體內(nèi)和體外快速誘導(dǎo)類骨磷灰石沉積并促進(jìn)骨組織相關(guān)細(xì)胞的增殖和分化。但生物材料植入人體后往往引起材料界面的細(xì)菌感染，造成植入體的松動(dòng)，甚至脫落，導(dǎo)致手術(shù)失敗。CU2因?yàn)榫哂袕V譜殺菌作用而在生物材料領(lǐng)域被廣泛運(yùn)用，并且最近的研究表明，CU2能促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCS增殖及骨相關(guān)基因表達(dá)，具有良好的細(xì)胞相容性。因此設(shè)計(jì)鈣硅銅CAOSIO2CUO三元體系的生物活性粒子，并將其裝載入PAA的納米孔道中，就可以綜合這些材料各自的優(yōu)勢(shì)，賦予PAA誘導(dǎo)類骨磷灰石沉積性能、良好的細(xì)胞相容性能以及優(yōu)良的抗菌性能，這在臨床醫(yī)學(xué)上具有重要的理論和醫(yī)用價(jià)值。本文利用高度有序大孔徑200NMPAA，采用超聲輔助的溶膠凝膠法制備出CAOSIO2PAA及CAOSIO2CUOPAA，通過(guò)模擬體液SBF浸泡實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了其誘導(dǎo)類骨磷灰石形成的能力及其離子緩釋性能，采用場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡FESEM、X射線能譜儀EDS、X射線光電子能譜分析儀XPS及傅立葉變換紅外光譜儀FTIR對(duì)材料的形貌、結(jié)構(gòu)和組成進(jìn)行了表征及分析。利用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀ICPAES分析離子釋放行為。然后，選用乳鼠成骨細(xì)胞進(jìn)行體外細(xì)胞粘附和增殖實(shí)驗(yàn)，并采用場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡FESEM對(duì)細(xì)胞粘附情況進(jìn)行表征。選用革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌STAPHYLOCOCCUSAUREUS，SAUREUS和革蘭氏陰性菌大腸桿菌ESCHERICHIACOLI，ECOLI進(jìn)行體外抗菌實(shí)驗(yàn)。獲得結(jié)論如下通過(guò)溶膠凝膠法及超聲輔助的減壓浸漬法將活性粒子CAOSIO2及CAOSIO2CUO填充進(jìn)了PAA納米孔道并保持了納米孔道原有的完整性，成功制備出的CAOSIO2PAA及CAOSIO2CUOPAA。通過(guò)SBF浸泡后CAOSIO2PAA及CAOSIO2CUOPAA表面都形成了致密的類骨磷灰石，并且能持繼緩慢釋放出CA2、SI2、CU2等離子，說(shuō)明CU2的加入并沒(méi)有影響其誘導(dǎo)類骨磷灰石形成能力和離子緩釋性能。乳鼠成骨細(xì)胞在材料表面粘附和增殖實(shí)驗(yàn)表明經(jīng)24H培養(yǎng)后，乳鼠成骨細(xì)胞粘附在材料表面，細(xì)胞形態(tài)正常。培養(yǎng)5D后，CAOSIO2CUOPAA能夠顯著促進(jìn)乳鼠成骨細(xì)胞增殖，呈現(xiàn)出良好的細(xì)胞相容性。抗菌性能測(cè)試結(jié)果表明經(jīng)24H培養(yǎng)后，CAOSIO2CUOPAA對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率分別為86％±4％和88％±2％，同時(shí)，CAOSIO2PAA對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌也具有一定的抗菌效果，其抑菌率分別為40％±4％和48％±3％。此外，由于內(nèi)植物感染的第一步是細(xì)菌在材料表面的粘附，因此植入材料的表面性質(zhì)對(duì)其抗菌性有決定性的影響。研究表明，材料表面的潤(rùn)濕性對(duì)細(xì)菌的粘附有較大影響，因此可以借助改變材料表面的潤(rùn)濕性來(lái)改變材料的抗菌效果。本文還采用低表面能物質(zhì)氟硅烷對(duì)PAA表面進(jìn)行修飾構(gòu)筑疏水性表面，通過(guò)比較親水性表面和疏水性表面對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌粘附作用，驗(yàn)證通過(guò)增加材料表面疏水性可提高其抗菌效果。獲得結(jié)論如下FTIR測(cè)試表明氟硅烷很好的修飾在了PAA表面，并且PAA表面接觸角由43°±3°提高為124°±4°?？咕阅軠y(cè)試結(jié)果表明經(jīng)6H培養(yǎng)后，PTESPAA（氟硅烷陽(yáng)極氧化鋁）對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌率分別為55％±3％和50％±3％，具有一定的抗菌效果。以上研究結(jié)果顯示，本文構(gòu)建的CAOSIO2CUOPAA具有優(yōu)異的誘導(dǎo)類骨磷灰石沉積能力，能夠顯著地促進(jìn)乳鼠成骨細(xì)胞的粘附和增殖，同時(shí)對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有有效抗菌性，這種多功效體系有望作為一種新型的人工植入材料的表面活性涂層而應(yīng)用于硬組織修復(fù)材料領(lǐng)域。此外，通過(guò)氟硅烷修飾構(gòu)筑的PTESPAA疏水性表面對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有一定的抗菌效果。

簡(jiǎn)介：博士學(xué)位論文（專業(yè)學(xué)位）S100A8基因在HL60細(xì)胞中的生物學(xué)作用及耐藥機(jī)制研究S100A8GENEOVEREXPRESSEDINHL60CELLLINEPROMOTINGTHECELL’SINVASIONMEDIATINGTHEIRRESISTANCETOETOPOSIDE研究生姓名楊小燕指導(dǎo)教師姓名胡紹燕專業(yè)名稱兒科學(xué)研究方向血液腫瘤所在院部?jī)嚎婆R床醫(yī)學(xué)院S100A8基因在HL60細(xì)胞中的生物學(xué)作用及耐藥機(jī)制研究中文摘要

簡(jiǎn)介：學(xué)校代碼10459學(xué)號(hào)或申請(qǐng)?zhí)柮芗?jí)公開(kāi)專業(yè)博士學(xué)位論文黏蛋白1激活A(yù)KT和ERK對(duì)非小細(xì)胞肺癌生物學(xué)特性影響作者姓名姚孟英導(dǎo)師姓名邢麗華教授專業(yè)學(xué)位名稱內(nèi)科學(xué)（呼吸專業(yè)）培養(yǎng)院系鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院完成時(shí)間2015年03月01日原創(chuàng)性聲明原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的科研成果。對(duì)本文的研究作出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本聲明的法律責(zé)任由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者日期年月日學(xué)位論文使用授權(quán)聲明學(xué)位論文使用授權(quán)聲明本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下完成的論文及相關(guān)的職務(wù)作品，知識(shí)產(chǎn)權(quán)歸屬鄭州大學(xué)。根據(jù)鄭州大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留或向國(guó)家有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱；本人授權(quán)鄭州大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或者其他復(fù)制手段保存論文和匯編本學(xué)位論文。本人離校后發(fā)表、使用學(xué)位論文或與該學(xué)位論文直接相關(guān)的學(xué)術(shù)論文或成果時(shí)，第一署名單位仍然為鄭州大學(xué)。保密論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定。學(xué)位論文作者日期年月日

簡(jiǎn)介：內(nèi)蒙古師范大學(xué)碩士學(xué)位論文新課程改革背景下高中生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課教學(xué)策略的探索與實(shí)施姓名李國(guó)萍申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)學(xué)科教學(xué)生物指導(dǎo)教師何曉萍20070605ABSTRACTTHEBIOLOGYEXPERIMENTTEACHINGISNOTONLYTHEACTIVITYOFATYPEOF1NVESNGATLONBUTALSOONEOFTHEBASICFORMSOFBIOLOGYTEACHINGINTHEHIGHSCHOOLTHECHARACTERISTICSOFBIOLOGICALEXPERIMENTANDTHEPOSITIONINTHEBLOIOGYTEACHINGDECIDESTHEIMPORTANTFUNCTIONINTHEBIOLOGYTEACHING．BUTINTHEPASTPAYINGATTENTIONTOBOOKKNOWLEDGETOOMUCHMADETHEBIOLOGICALEXPERIMENTBECOMEVERIFICATINGANDREAPPEARINGTHESIMPLEKNOWLEDGE．THEOXPENMENTSWEREJUSTDONEREPEATLYANDMECHANCLYBASEDONTHEEXISTIN2ANDFIXEDMODE．IFWESTICKTOTHETRADITIONALMODE，THEPEOPLEWECUITIVATEDWILLBECOMETHEPERSONSLACKOFKNOWLEDGE，STAGNANTINTHINKINGANDLACKOFSUBJECTIONANDCREATION，ANDISHARDTOADAPTSOCIALDEVELOPMENT．THEWRITERTHINKTHATTHEREISNECESSITYINVESTIGATINGCURRENTBIOLOGYANEXPERIMENTTHEPRESENTCONDITIONOFTHELESSONTEACHINGUNDERANEWBACKGROUNDOFCOURSEREFORM，F(xiàn)INDOUTASTRATEGYFORTHESTUDENTSTOLEARNANDTHETEACHERSTOTEACH．TAKE”FACETOTHEWHOLESTUDENTS，RAISELIVINGCREATURESCIENCECULTIVATEDMANNERSANDINITIATEALLINVESTIGATINGSTUDY”ASATARGETANDGROPEFORPOSSIBILITYSTRATEGYINKEEPINGWITHSTUDENTACTUALITYINDOINGBIOLOGYEXPERIMENTS，TORAISEAVALIDTEACHINGPERFORMANCEANDTRAINTHESTUDENTS，TESTINGABILITYCOMPLETELY．THISTOPICBELONGSTOTHECOMPREHENSIVERESEARCHTHATTHEFOUNDATIONRESEARCHCOMBINESTOGETHERWITHAPPLICATIONSTUDY．THEMETHODSOFSTUDYMAINLYHAVETHECULTURALHERITAGEMETHOD，QUESTIONNAIRESURVEY，THEMETHODOFINQUISITION．THEWRITERREADSAGREATDEALOFCULTURALHERITAGEANDCONCLUDESTHECONTENTOFCOURSEOFTHESENIORHIGHSCHOOLBIOLOGYEXPERIMENTLESSONWITHRELATEDTHEORIESANDTHEEXAMINITIONEXPERIMENTQUESTIONSFORSTUDENTSABILITY

簡(jiǎn)介：靜態(tài)牽張力作用下健康和牙周病微環(huán)境來(lái)源靜態(tài)牽張力作用下健康和牙周病微環(huán)境來(lái)源PDLSCS生物學(xué)功能及生物學(xué)功能及LNCRNA表達(dá)譜的研究表達(dá)譜的研究劉佳學(xué)號(hào)1312013172培養(yǎng)類別全日制學(xué)位類型學(xué)術(shù)學(xué)位一級(jí)學(xué)科專業(yè)類口腔醫(yī)學(xué)二級(jí)學(xué)科專業(yè)口腔臨床醫(yī)學(xué)（正畸）研究方向牙周病正畸治療及其機(jī)制研究指導(dǎo)教師金作林教授（主任醫(yī)師）培養(yǎng)單位第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院正畸科二O一六年五月分類號(hào)R783UDC6163密級(jí)公開(kāi)第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文目錄縮略語(yǔ)表1中文摘要3英文摘要8前言15文獻(xiàn)回顧17正文28第一部分HPDLSCS和PPDLSCS對(duì)不同級(jí)別SMS的反應(yīng)及最佳力值篩選28實(shí)驗(yàn)一HPDLSCS和PPDLSCS的培養(yǎng)、鑒定及SMS加載裝置的建立301材料3011主要儀器3012主要試劑302方法3121HPDLSCS和PPDLSCS的細(xì)胞來(lái)源3122HPDLSCS和PPDLSCS的細(xì)胞原代培養(yǎng)及純化3123HPDLSCS和PPDLSCS的生物學(xué)特性鑒定3224SMS加載裝置的構(gòu)建3325統(tǒng)計(jì)學(xué)分析333結(jié)果3431HPDLSCS及PPDLSCS形態(tài)學(xué)觀察3432HPDLSCS及PPDLSCS表面分子表型鑒定3433HPDLSCS及PPDLSCS克隆形成能力鑒定3534HPDLSCS及PPDLSCS多向分化能力鑒定3635SMS加載裝置的構(gòu)建384討論38實(shí)驗(yàn)二不同級(jí)別SMS對(duì)HPDLSCS和PPDLSCS增殖及成骨能力的影響401材料4011主要儀器4012主要試劑402方法4121HPDLSCS及PPDLSCS的增殖能力檢測(cè)41