miR-27b在胃癌中的生物學(xué)功能及表遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、前言:腫瘤目前已經(jīng)成為了常見病多發(fā)疾病。據(jù)估算，在世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤中，胃癌排名第四，而在腫瘤引起的相關(guān)死亡中胃癌排名第二。研究表明，異常的miR-27b表達(dá)發(fā)生在多種腫瘤中，包括胃癌。然而，miR-27b在胃癌中調(diào)控機(jī)制及其生物學(xué)功能和臨床意義尚且未知，因此，在本研究中，我們對(duì)miR-27b在胃癌中的表達(dá)情況，以及其miR-27b對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響進(jìn)行了研究，在此基礎(chǔ)上，我們從表遺傳學(xué)角度對(duì)miR-27b在胃癌細(xì)胞的異

2、常表達(dá)進(jìn)行了深入分析。
　　材料和方法:1.80對(duì)胃組織樣本，包括80例胃癌組織和配對(duì)的癌旁正常組織，被用于本實(shí)驗(yàn)研究。他們來自于2013-2014年在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院被確診為胃癌的患者，這些患者在手術(shù)之前未進(jìn)行放化療等任何其他治療手段。2.所有組織進(jìn)行H&E染色處理并進(jìn)行組織學(xué)診斷。3.四株胃癌細(xì)胞BGC-823，MGC-803，SGC-7901，MKN-45和一株正常胃粘膜上皮細(xì)胞GES-1。所有的細(xì)胞均培養(yǎng)在含10％

3、胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中，并被放入含5％二氧化碳的37℃的恒溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)。4.Trizol試劑被用在本實(shí)驗(yàn)中對(duì)全基因組RNA進(jìn)行提取。miR-27b在胃癌細(xì)胞系和胃癌組織中的表達(dá)量通過實(shí)時(shí)定量RT-PCR進(jìn)行定量檢測(cè)。4.在轉(zhuǎn)染試劑的作用下，miR-27b低表達(dá)的胃癌細(xì)胞分別被轉(zhuǎn)入miR-27b mimics、miR-27b Inhibitor、scramble，或者未被轉(zhuǎn)染。細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲和細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)被用來研究miR-27b對(duì)

4、胃癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響。5.在線生物預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)miR-27b的可能靶基因，通過查閱文獻(xiàn)進(jìn)一步篩選，并利用雙熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。Western blot檢測(cè)靶基因在胃癌組織和細(xì)胞中的蛋白表達(dá)情況。6.去甲基化藥物5-AZA-CdR and/or TSA處理胃癌細(xì)胞。MSP進(jìn)行檢測(cè)胃癌細(xì)胞系和胃組織中miR-27b基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化水平。6.利用SPSS17.0軟件對(duì)胃癌組織及癌旁正常組織中miR-27b的表達(dá)水平

5、進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。主要統(tǒng)計(jì)方法采用t檢驗(yàn)（或者方差分析），P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05表示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:1.與正常胃粘膜上皮細(xì)胞相比，miR-27b在胃癌細(xì)胞株(MKN-45，SGC-7901，BGC-823，MGC-803)中表達(dá)水平明顯降低。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)miR-27b在胃癌組織中的表達(dá)水平相比在癌旁正常組織中的表達(dá)水平更低。2.表達(dá)miR-27b可以抑制胃癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

6、下調(diào)miR-27b表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲并抑制胃癌細(xì)胞凋亡。3.通過甲基化特異性PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與正常胃癌粘膜上皮細(xì)胞相比，胃癌細(xì)胞中miR-27b啟動(dòng)子區(qū)CpG島呈現(xiàn)異常高甲基化狀態(tài)，在胃癌細(xì)胞系MKN-45中尤為明顯。并且，我們也發(fā)現(xiàn)，在miR-27b低表達(dá)的胃癌組織中miR-27b啟動(dòng)子區(qū)CpG島呈現(xiàn)出比miR-27b高表達(dá)的胃癌組織中更高的甲基化水平。更重要的是，我們發(fā)現(xiàn)，miR-27b啟動(dòng)子區(qū)的這種高甲基化狀態(tài)可以被去甲基

7、化藥物5-Aza-dC部分逆轉(zhuǎn)。4.miR-27b通過與GSPT13'UTRs結(jié)合而抑制其蛋白表達(dá)。結(jié)論:我們的研究表明，異常低表達(dá)的miR-27b在胃癌中扮演了腫瘤抑制基因的作用，并且miR-27b低表達(dá)部分原因是其啟動(dòng)子區(qū)CpG島高甲基化;這說明miR-27b可能具有發(fā)展為胃癌潛在的治療靶標(biāo)。
　　結(jié)論:我們的研究表明，下調(diào)表達(dá)的miR-27b在胃癌中扮演了抑癌基因的角色，它的低表達(dá)部分是由于其啟動(dòng)子區(qū)CpG島高甲基化，這些結(jié)