ω3多不飽和脂肪酸改善失血休克大鼠心肌收縮功能的作用與機制.pdf

1、心肌收縮功能在維持血流動力學(xué)、組織灌流中起著主要作用。失血性休克時，因有效循環(huán)血量降低，直接引起低血壓，導(dǎo)致胃腸道的缺血缺氧，細菌及內(nèi)毒素等有害物質(zhì)經(jīng)過腸淋巴系統(tǒng)進入血液，通過多種途徑參與心肌的損傷，最終導(dǎo)致心肌功能障礙。因此，休克救治的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是如何改善心肌收縮功能障礙，恢復(fù)心泵功能?？梢?，深入探索休克后心肌收縮功能障礙的發(fā)生機制，對于尋找心肌干預(yù)措施、防治重癥休克及其導(dǎo)致的多器官功能障礙具有重要的臨床意義。
　　ω3多不飽和脂

2、肪酸(ω-3PUFAs)作為一種營養(yǎng)素以及細胞膜成分之一，除了參與脂類介質(zhì)合成外，還參與了炎癥因子的生成與釋放過程，進而調(diào)控炎癥反應(yīng)，影響某些免疫細胞的功能，同樣還發(fā)揮著改善腸屏障功能的作用。細胞自噬在各種生命活動中，具有重要病理生理意義，參與了多種疾病的發(fā)生與發(fā)展;同樣，細胞自噬在失血性休克后器官損傷的發(fā)病學(xué)中具有一定的作用。但是，ω-3PUFAs是否能改善失血性休克后的心肌收縮功能，其作用機制是否與細胞自噬有關(guān)？未見報道。
　

3、　為此，本實驗在觀察ω-3PUFAs對失血性休克大鼠存活時間與生存率作用的基礎(chǔ)上，進一步探究ω-3PUFAs及自噬工具藥對失血性休克大鼠心肌組織損傷、收縮功能、細胞自噬的作用，并從腸損傷角度探討其相關(guān)機制，以期為防治失血性休克引起的心肌收縮功能障礙提供一定的實驗資料。
　　首先，建立失血性休克大鼠模型。將健康雄性大鼠放入美國MATRX動物麻醉機的塑料盒中吸入3％異氟烷誘導(dǎo)麻醉，氧流量控制在1～1.5L/min，1～3min進入手術(shù)

4、需要的麻醉狀態(tài)，將大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺上并連接大鼠專用無創(chuàng)氧氣面罩，轉(zhuǎn)入1.5％異氟烷維持麻醉狀態(tài)。然后，實施雙側(cè)股動脈及單側(cè)股靜脈插管，備放血及肝素抗凝。手術(shù)結(jié)束后，穩(wěn)定30min,大鼠在清醒狀態(tài)下，10min內(nèi)勻速放出大鼠全身血量的40％、維持低血壓1h后進行液體復(fù)蘇，建立清醒失血性休克大鼠模型。
　　將12只健康雄性大鼠分成兩個組，分別是休克組(shock)、Shock+ω-3PuFAs組，觀察ω-3PuFAs對失血性休克

5、大鼠存活時間與存活率的作用;結(jié)果顯示，Shock組的6只大鼠在30h內(nèi)死亡，Shock+ω-3PuFAs治療組3只大鼠的存活時間均超過了50h，其余3只在30h內(nèi)死亡。研究結(jié)果提示ω-3PuFAs對失血性休克具有良好的干預(yù)作用。
　　為進一步驗證ω-3PUFAs對失血性休克大鼠心肌收縮功能的作用，取12只健康大鼠常規(guī)方法建立失血性休克模型，液體復(fù)蘇后行腸淋巴管插管，留取休克腸淋巴液(PHSML)，用于后續(xù)的實驗研究;然后將48只大

6、鼠隨機分為8組:假手術(shù)組(Sham)、Sham+ω-3PuFAs組、Shock組、Shock+ω-3PuFAs組、Shock+PHSML+ω-3PuFAs組、Shock+3-甲基腺嘌呤(3-MA)組、Shock+ω-3PUFAs+雷帕霉素(RAPA)組，Shock+ω-3PUFAs+3-MA+PHSML組，每組6只。其中，Shock組、Shock+ω-3PuFAs組、Shock+PHSML+ω-3PuFAs組、Shock+3-MA組、S

7、hock+ω-3PUFAs+RAPA組、Shock+ω-3PUFAs+PHSML+3-MA組按前述方法建立清醒失血性休克模型，維持低血壓60min后行液體復(fù)蘇:Shock組輸入放出全血加等量復(fù)方氯化鈉液;Shock+ω-3PuFAs組輸入放出全血加含有ω-3PuFAs(0.2g/kg)等量復(fù)方氯化鈉液;Shock+ω-3PuFAs+PHSML組輸入放出全血及含有ω-3PuFAs(0.2g/kg)、PHSML(1ml/kg)等量復(fù)方氯化鈉

8、液;Shock+RAPA+ω-3PUFAs組在輸入放出全血及含有ω-3PuFAs(0.2g/kg)等量復(fù)方氯化鈉液的同時，腹腔注射RAPA（10mg/kg）;Shock+ω-3PUFAs+PHSML+3-MA組輸入放出全血及含有ω-3PuFAs(0.2g/kg)、3-MA(30mg/kg)、PHSML(1ml/kg)等量復(fù)方氯化鈉液;Shock+3-MA組輸入放出全血及包含3-MA（30mg/kg）的等量復(fù)方氯化鈉液。Sham組、Sha

9、m+ω-3PuFAs組大鼠實施與休克組同樣手術(shù)、但不放血;在與Shock組進行液體復(fù)蘇相同的時間內(nèi)，Sham組靜脈輸入等血量復(fù)方氯化鈉液、Sham+ω-3PuFAs組靜脈輸入含有ω-3PuFAs（0.2g/kg）的等量復(fù)方氯化鈉液。
　　在液體復(fù)蘇結(jié)束后3h或相應(yīng)時間點，行胸、腹部手術(shù)，經(jīng)腹主動脈穿刺留取全血標本，制備血漿，用于檢測生化指標;然后，快速剪下心臟測定離體心臟收縮功能，待離體心臟灌流之后留取心室一部分置于4％的多聚甲醛

10、中，用于觀察組織形態(tài)學(xué)以及應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法檢測細胞自噬標志物微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3Ⅱ)表達，其它心臟組織凍存于低溫冰箱中;同時，留取腸組織（回盲部10cm），取2cm測腸濕重，烤干后測干重，計算濕/干比，取2cm腸固定于4％多聚甲醛中，用于組織形態(tài)學(xué)觀察。
　　研究結(jié)果表明，失血性休克大鼠血漿CK-MB、LDH-L活性均顯著高于Sham與Sham+ω-3PUFAs組;ω-3PUFAs治療降低了失血性休克大鼠血漿CK-M

11、B、LDH-L活性，3-MA治療對二者無明顯作用;靜脈輸入休克腸淋巴液廢除了ω-3PUFAs降低失血性休克大鼠血漿CK-MB、LDH-L活性的作用;RAPA抑制了ω-3PUFAs降低失血性休克大鼠血漿CK-MB、LDH-L活性的作用;3-MA治療卻進一步提高了靜脈輸入休克腸淋巴液對提高大鼠血漿CK-MB的負性作用。此外，失血性休克引起了大鼠心肌組織肌絲斷裂、水腫，增加了LC3-Ⅱ表達;ω-3PUFAs及3-MA治療可明顯改善心肌細胞損傷

12、，降低LC3-Ⅱ表達;靜脈輸入PHSML及RAPA治療均抑制了ω-3PUFAs的有利作用;3-MA治療對靜脈輸入PHSML有一定的抑制作用。
　　離體心臟功能結(jié)果顯示，失血性休克大鼠離體心臟的±dP/dt max以及LVSP均顯著低于Sham與Sham+ω-3PUFAs組，HR與LVEDP未見統(tǒng)計學(xué)差異;ω-3PUFAs治療提高了失血性休克大鼠離體心臟的±dP/dt max以及LVSP;此外，靜脈輸入休克腸淋巴液廢除了ω-3PUF

13、As對失血性休克大鼠離體心臟的有利作用，表現(xiàn)在顯著降低了±dP/dt max以及LVSP水平。自噬特異性抑制劑3-MA提高了失血性休克大鼠離體心臟的±dP/dt max以及LVSP，對HR與LVEDP無明顯作用;自噬激活劑RAPA對失血性休克大鼠經(jīng)ω-3PUFAs治療后離體心臟的±dP/dt max、LVSP、HR與LVEDP均無明顯作用;3-MA治療進一步抑制了靜脈輸入休克腸淋巴液對大鼠離體心臟的負性作用，表現(xiàn)在顯著提高±dP/dt

14、max以及LVSP、降低LVEDP水平。
　　針對腸損傷研究的指標顯示，失血性休克大鼠腸組織評分、濕干比值均顯著高于Sham與Sham+ω-3PUFAs組;ω-3PUFAs與3-MA治療降低了失血性休克大鼠腸組織評分、濕干比值;靜脈輸入PHSML廢除了ω-3PUFAs降低失血性休克大鼠腸組織評分、濕干比值的作用;3-MA治療進一步抑制了靜脈輸入PHSML對提高大鼠腸組織評分、濕干比值的負性作用。同時，失血性休克大鼠血漿D-LA、I

15、-FABP水平均顯著高于Sham與Sham+ω-3PUFAs組;ωω-3PUFAs與3-MA治療降低了失血性休克大鼠血漿D-LA、I-FABP水平;靜脈輸入休克腸淋巴液廢除了ω-3PUFAs降低失血性休克大鼠血漿D-LA水平的作用，對I-FABP無明顯作用;3-MA治療卻進一步提高了靜脈輸入休克腸淋巴液對提高大鼠血漿D-LA、I-FABP的負性作用。
　　上述研究表明，ω-3PUFAs提高失血性休克大鼠的存活時間，改善大鼠休克后心