TLR2調(diào)控角膜移植術(shù)后MDSC分化及DC成熟.pdf

1、研究背景：
　　角膜移植手術(shù)是目前治療不可逆性角膜盲唯一有效手段。盡管角膜一直被稱作“免疫赦免”組織，但移植術(shù)后的免疫排斥反應(yīng)仍是導(dǎo)致移植失敗最主要的原因。角膜移植排斥反應(yīng)是以CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)為主的Th1型免疫反應(yīng)。干擾素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)的增高決定T細(xì)胞向Th1方向分化，是Th1型免疫反應(yīng)的特征性因子。CD4+T細(xì)胞的激活不僅需要T細(xì)胞表面受體(T eel1receptor，TCR)-主要組織相容性抗

2、原(Major histocompatibility complex，MHC)肽復(fù)合體的結(jié)合，還需要抗原提呈細(xì)胞(Antigen-presenting cell，APC)提呈抗原。骨髓抑制性細(xì)胞(Myeloid-derived suppressor cell，MDSC)是APC的前體，不具備抗原提呈功能，無法激活T細(xì)胞。另外，MDSC也可通過多種途徑抑制T細(xì)胞活化。其中最主要的途徑是分泌誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(Induced nitric

3、oxidesynthase，INOS)，降低T細(xì)胞活性。樹突狀細(xì)胞（Dendritic cell，DC）是目前認(rèn)為最有效的APC。成熟后的DC(Mature DC，mDC)，表面高表達(dá)B7/BB1(CD80/CD86)分子，這是遞呈抗原從而激活T細(xì)胞的必備條件。因此，MDSC、DC的產(chǎn)生和活化與CD4+T細(xì)胞激活關(guān)系十分密切。
　　Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)2是廣泛表達(dá)于免疫細(xì)胞表面的模式識別受

4、體。我們課題組前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，TLR2可能參與了大鼠角膜移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生，但其具體機(jī)制仍不十分明確。在體外實驗中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)激活TLR2可以促進(jìn)MDSC向DC分化，并對MDSC活化和DC成熟有一定影響。因此我們猜測TLR2可能通過調(diào)控MDSC分化和DC成熟參與角膜移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生。
　　本實驗將利用TLR2基因敲除小鼠建立同種異體角膜移植模型，與野生型同種異體角膜移植小鼠進(jìn)行比較，從而驗證TLR2與角膜移植術(shù)后

5、免疫排斥反應(yīng)發(fā)生的關(guān)系，并進(jìn)一步探究這一現(xiàn)象背后的機(jī)制。
　　實驗一 TLR2敲除后可延長角膜植片生存時間
　　研究目的：
　　驗證TLR2參與角膜移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生。
　　研究方法：
　　以野生型C57BL/6和TLR2基因敲除小鼠為受體，BABL/c小鼠為供體，在受體小鼠右眼行同種異體角膜移植術(shù)，分別設(shè)為野生組（WT組）和基因敲除組（TLR2 KO組）;另外于C57BL/6小鼠右眼行自體角膜移植

6、術(shù)，設(shè)為自體組(ISO組)。未經(jīng)手術(shù)處理的C57BL/6和TLR2基因敲除小鼠分別設(shè)為野生對照組(WTcontrol)和基因敲除對照組(KO control)。術(shù)后2次/周裂隙燈下觀察植片水腫程度和透明度，參照Sonoda評分標(biāo)準(zhǔn)對排斥指數(shù)（Reject index，RI）進(jìn)行評分并計算中位生存時間(Median survival time，MST)。比較WT組與TLR2 KO組間植片生存時間長短。
　　研究結(jié)果：
　　術(shù)后

7、隨時間變化各手術(shù)組植片水腫和混濁程度不一，以WT組最為嚴(yán)重。比較角膜RI評分顯示，術(shù)后7d、14d、21d、28d、35d、42d、49 d和56d，TLR2KO組RI評分均低于WT組(P＜0.05)。比較MST結(jié)果顯示，TLR2 KO組（35.0±3.8）d明顯長于WT組（21.0±1.5）d(P＜0.05)。生存分析結(jié)果顯示，TLR2 KO組角膜生存時間明顯長于WT組(P＜0.001)，術(shù)后14d TLR2 KO組角膜生存率為100

8、％，而WT組僅為70％。
　　結(jié)論：
　　TLR2敲除后可延長角膜植片生存時間，再次驗證TLR2可能參與角膜移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生。
　　實驗二 TLR2調(diào)控角膜植片局部免疫反應(yīng)發(fā)生
　　研究目的：
　　探究TLR2是否調(diào)控同種異體移植角膜植片局部的免疫反應(yīng)的發(fā)生。
　　研究方法
　　建立WT組、TLR2 KO組、ISO組、WT control組和KO control組五組小鼠（方法同前）。

9、術(shù)后14d，收集術(shù)眼角膜行HE染色分析炎癥細(xì)胞浸潤程度;免疫組織化學(xué)染色檢測角膜TLR2及Th1細(xì)胞因子(IFN-γ)蛋白表達(dá);實時熒光定量PCR檢測TLR2及IFN-γ mRNA的表達(dá);同時收集術(shù)眼同側(cè)頸部淋巴結(jié)行流式細(xì)胞術(shù)分析CD4+T細(xì)胞(CD3+CD4+)的比例。
　　研究結(jié)果：
　　TLR2免疫組織化學(xué)和PCR結(jié)果顯示，TLR2 KO組角膜幾乎不表達(dá)TLR2分子，ISO組有微量表達(dá)，WT組表達(dá)明顯增高。HE染色結(jié)果

10、顯示，WT組角膜基質(zhì)層出現(xiàn)水腫和大量炎性細(xì)胞，而TLR2 KO組炎癥反應(yīng)較輕。流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，WT組同側(cè)頸部淋巴結(jié)中CD4+T細(xì)胞數(shù)量明顯高于TLR2 KO組(P＜0.05)。免疫組織化學(xué)和PCR結(jié)果顯示，WT組相對于TLR2 KO組，角膜植片內(nèi)IFN-γ表達(dá)增高(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　TLR2表達(dá)高低與植片局部免疫反應(yīng)強(qiáng)弱相關(guān)，提示TLR2可能參與了同種異體移植角膜植片局部的免疫反應(yīng)的發(fā)生。
　　實

11、驗三 TLR2調(diào)控MDSC分化及DC成熟
　　研究目的：
　　探究TLR2是否調(diào)控MDSC分化及DC成熟。
　　研究方法：
　　建立WT組、TLR2 KO組、ISO組、WT control組和KO control組五組小鼠（方法同前）。術(shù)后14d，收集術(shù)眼角膜行實時熒光定量PCR檢測INOS mRNA表達(dá)分析各組MDSC功能差異;免疫熒光染色檢測角膜局部MDSC、DC數(shù)量分析各組MDSC向DC分化的情況，以及CD

12、80/CD86表達(dá)強(qiáng)弱分析各組DC成熟的情況。同時收集術(shù)眼同側(cè)頸部淋巴結(jié)行流式細(xì)胞術(shù)定量分析MDSC(CD11b+GR-1+)、DC(CD11c+)的比例和和mDC(CD11c+CD86 high/CD80high)的表達(dá)。
　　研究結(jié)果：
　　PCR結(jié)果顯示，WT組與TLR2 KO組間角膜局部INOS mRNA表達(dá)無明顯的差異(P＞0.05)。MDSC和DC的流式細(xì)胞分析和免疫熒光結(jié)果結(jié)果顯示，WT組相對于TLR2 KO組