粗糙型豬霍亂沙門(mén)菌與鼠傷寒沙門(mén)菌rfaJ基因缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究.pdf

1、食品安全是一重要的社會(huì)民生問(wèn)題，豬肉是人類主要的動(dòng)物食品，但豬及其制品易受沙門(mén)菌感染，威脅著食品安全及人類健康。豬霍亂沙門(mén)菌為宿主適應(yīng)性沙門(mén)菌，易引起2-4月齡仔豬副傷寒病，發(fā)病死亡率較高，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)中有著嚴(yán)重的危害。同時(shí)，鼠傷寒沙門(mén)菌作為沙門(mén)菌最常見(jiàn)血清型，其動(dòng)物宿主廣泛，包括豬，是重要的食源性病原菌之一，也是人類食物中毒主要原因。實(shí)踐證明，疫苗是防控豬沙門(mén)菌病的有效措施之一。
　　豬霍亂沙門(mén)菌C500株已經(jīng)作為減毒疫苗使用40余

2、年，該疫苗可從動(dòng)物飼養(yǎng)源頭控制沙門(mén)菌對(duì)動(dòng)物的感染和侵害，能有效預(yù)防仔豬副傷寒，并減少沙門(mén)菌對(duì)肉產(chǎn)品的污染，從而減少沙門(mén)菌通過(guò)食物鏈感染人類，阻斷沙門(mén)菌人畜之間傳播，防止沙門(mén)菌病的發(fā)生。該疫苗在疾病防控中發(fā)揮重大作用，但遺憾的是動(dòng)物接種該疫苗后不能通過(guò)基于玻板凝集的試驗(yàn)方法，簡(jiǎn)單快速鑒別動(dòng)物是被免疫還是被感染(Differentiating Infected from VaccinatedAnimals，DIVA)。為此，本研究構(gòu)建豬霍亂

3、沙門(mén)菌的LPS相關(guān)基因rfaJ缺失株，致力于區(qū)分免疫動(dòng)物和自然感染動(dòng)物。另外，還構(gòu)建了鼠傷寒沙門(mén)菌D6的faJ缺失株，并對(duì)它們生物學(xué)特性和免疫保護(hù)進(jìn)行了評(píng)價(jià)，初步探索了rfaJ基因在DIVA疫苗設(shè)計(jì)及其鑒別診斷中的應(yīng)用潛能。
　　1.豬霍亂沙門(mén)菌rfaJ基因缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究
　　本研究利用λ-red同源重組方法構(gòu)建了豬霍亂沙門(mén)菌C500ΔrfaJ缺失株，測(cè)序和PCR鑒定結(jié)果表明，rfaJ基因從基因組中缺失，同時(shí)

4、構(gòu)建了回復(fù)株C500Δrfa∷rfaJ。缺失株C500ΔrfaJ的生長(zhǎng)速度與野生株C500相比無(wú)明顯變化，液體培養(yǎng)缺失株C500ΔrfaJ易發(fā)生自凝集沉淀現(xiàn)象。與親本株C500相比，缺失株LPS結(jié)構(gòu)因O抗原缺失而不再完整，細(xì)菌由光滑型變?yōu)榇植谛?。C500ΔrfaJ免疫后的小鼠血清不與親本株C500發(fā)生凝集，能夠區(qū)分感染動(dòng)物和免疫動(dòng)物的血清。缺失株C500ΔrfaJ感染豬空腸上皮細(xì)胞IPEC-J2后，缺失株C500ΔrfaJ對(duì)細(xì)胞的黏附和

5、侵染能力有明顯下降(P＜0.01），其在細(xì)胞內(nèi)增殖能力無(wú)顯著變化。熒光定量PCR方法檢測(cè)C500ΔrfaJ刺激細(xì)胞后細(xì)胞炎性因子mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與親本株C500感染細(xì)胞組相比，TNF-α、IL-4與IL-6表達(dá)水平明顯下降。
　　2.鼠傷寒沙門(mén)菌rfJ基因缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究
　　以鼠傷寒沙門(mén)菌D6為研究對(duì)象，構(gòu)建了D6ΔrfaJ基因缺失株及其回復(fù)株D6ΔrfaJ∷rfaJ。鼠傷寒沙門(mén)菌D6ΔrfaJ基

6、因缺失株生物特性與豬霍亂沙門(mén)菌缺失株C500ΔrfaJ的生物特性基本一致。缺失株D6ΔrfaJ生長(zhǎng)速度與野生株相比無(wú)明顯變化，液體培養(yǎng)過(guò)程中缺失株發(fā)生自凝集沉淀;與其親本株D6相比較，D6ΔrfaJ的LPS結(jié)構(gòu)因O抗原缺失不再完整，細(xì)菌由光滑型變?yōu)榇植谛?，D6ΔrfaJ免疫后的小鼠血清不與其親本株D6發(fā)生凝集。然而，有些生物學(xué)特性發(fā)生了改變，多項(xiàng)生化指標(biāo)發(fā)生改變，缺失株運(yùn)動(dòng)能力下降。以缺失株D6ΔrfaJ和親本株D6分別感染豬空腸上皮細(xì)

7、胞IPEC-J2后發(fā)現(xiàn)，缺失株D6ΔrfaJ對(duì)細(xì)胞的黏附和侵染能力有明顯下降，但增殖能力無(wú)特別明顯變化，并在感染8h后缺失株的增殖能力超過(guò)親本株D6;以BALB/c為動(dòng)物模型，口服途徑免疫6周齡小鼠，間隔2周，再次免疫，2周后以口服途徑攻毒，對(duì)D6ΔrfaJ進(jìn)行了免疫保護(hù)效力評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，血清中抗體水平在14d時(shí)達(dá)到較高水平，并且小鼠經(jīng)2次免疫后兩周，能夠?qū)Ω叨玖闟L1344提供80％的免疫保護(hù);缺失株D6ΔrfaJ在體內(nèi)臟器和糞