鬼臼苦素抗CML干細胞的作用及其機制研究.pdf

1、慢性粒細胞白血病（Chronic Myeloid Leukemia，CML）是一種起源于白血病干細胞（Leukemia Stem Cell，LSC）并嚴重威脅人類健康的惡性增殖性疾病。Ph染色體是CML的重要標志，它源于第9號染色體和22號染色體相互易位，使第9號染色體上大部分的c-abl原癌基因易位到22號染色體的BCR基因上而形成一個融合的BCR/ABL融合基因。該基因編碼的蛋白質(zhì)P210bcr/abl具有異常活躍的酪氨酸激酶活性，

2、是導致CML發(fā)生的主要機制。格列衛(wèi)（IM）是以bcr/abl融合蛋白為靶點的酪氨酸激酶抑制劑，能是大部分的CML患者得到有效的緩解。然而，由于LSC不依賴BCR-ABL的蛋白激酶活性存活，導致格列衛(wèi)不能徹底清除LSC而無法治愈CML，患者必須長期服藥以控制病情。格列衛(wèi)價格昂貴，終生用藥給患者造成沉重的經(jīng)濟負擔。而且，長期用藥將導致更多的副作用和耐藥的發(fā)生。因此，迫切需要探尋有效靶向清除CML LSC的方法，以期根治CML。
　　鬼

3、臼毒素是我國傳統(tǒng)中藥鬼臼的活性成分，但由于其是通過抑制微管蛋白發(fā)揮作用，故毒性大，限制了臨床的直接應用。鬼臼苦素(picropodophyllin，PPP)是鬼臼毒素的異構(gòu)體，具有順式內(nèi)酯環(huán)，對微管蛋白沒有抑制作用，故不具有細胞毒性。許多研究結(jié)果顯示，鬼臼苦素也具有廣泛的抗腫瘤效應，但是對正常細胞基本上沒有毒性。這表明鬼臼苦素對腫瘤細胞有一定的特異性。目前，有報道發(fā)現(xiàn)鬼臼苦素能有效誘導CML原代細胞和細胞系發(fā)生細胞凋亡，以及抑制細胞系的

4、克隆形成，但是鬼臼苦素對CML LSC的研究尚無報道，值得深入研究。為此，本研究分為三部分進行闡述：
　　1，鬼臼苦素體外抗CML LSC的作用；
　　2，以CML轉(zhuǎn)基因小鼠為模型研究鬼臼苦素在體內(nèi)抗LSC的作用；
　　3，鬼臼苦素靶向抗CML LSC的分子機制。
　　研究目的：
　　本論文通過研究鬼臼苦素體內(nèi)外抗CML LSC的作用，闡明其分子調(diào)控機制，將為PPP研發(fā)成為新型的靶向LSC治療CML的臨床藥

5、物提供重要的理論和實驗基礎(chǔ)。
　　研究方法：
　　1.探討鬼臼苦素體外抗人CML LSC的作用
　　1.1.利用淋巴細胞分離液分離獲得CML患者和健康人（health donor，HD）的骨髓單個核細胞；利用免疫磁珠分選系統(tǒng)對CML和HD的骨髓單個核細胞進行分選，獲得CML和健康人的CD34+細胞；流式細胞術(shù)鑒定分選出的CD34+細胞純度。
　　1.2.流式細胞術(shù)檢測PPP誘導的CML和健康人干細胞凋亡情況；克隆

6、形成實驗檢測PPP處理后CML和健康人CD34+細胞克隆形成數(shù)量。
　　2.探討鬼臼苦素抗SCL-tTA/BCR-ABL轉(zhuǎn)基因小鼠LSC的作用
　　2.1.將BCR-ABL轉(zhuǎn)基因小鼠和SCL-tTA轉(zhuǎn)基因小鼠進行雜交得到SCL-tTA/BCR-ABL小鼠（CML小鼠），誘導發(fā)病后用流式細胞術(shù)和組織HE染色的方法對其表型和組織形態(tài)進行鑒定。
　　2.2.檢測PPP治療對CML和野生型小鼠體重以及骨髓LSC比例和數(shù)目的影響

7、。
　　3.探討鬼臼苦素抗CML LSC的作用機制
　　3.1.Western blotting檢測CML CD34+細胞經(jīng)過PPP處理后細胞內(nèi)P53蛋白磷酸化及乙酰化水平；Realtime PCR（qPCR）檢測CML CD34+細胞經(jīng)過PPP處理后P53及其下游調(diào)控基因P21、Puma、Noxa、Bax表達水平；qPCR檢測CML CD34+細胞經(jīng)過PPP處理后c-Myc和BCL2表達水平；qPCR檢測PPP治療后小鼠骨

8、髓細胞P21、Noxa和Bax基因表達水平。
　　3.2.qPCR檢測CML和健康人骨髓單核細胞、CD34+CD38-細胞、CD34+CD38+細胞IGF1R基因的表達水平；ELISA方法檢測CML和健康人骨髓上清中IGF1、IGF2的表達；流式細胞術(shù)檢測CML和健康人骨髓單核細胞IGF1R蛋白的表達；流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染IGF1RsiRNA后對K562細胞凋亡的影響；Western blotting檢測PPP和IGF1R特異性抑制

9、劑（OSI-906和AG-1024）對K562、Ku812細胞內(nèi)IGF1R活性及其下游調(diào)控蛋白活性的影響；流式細胞術(shù)檢測OSI-906和AG-1024對CMLCD34+細胞凋亡的影響。
　　實驗結(jié)果：
　　1.探討鬼臼苦素體外抗人CML LSC的作用
　　1.1.流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，免疫磁珠分選出的CD34+細胞純度為89.23％，符合實驗需求。
　　1.2流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，PPP能夠誘導CML CD34+

10、CD38-（LSC）和CD34+CD38+祖細胞發(fā)生顯著的細胞凋亡，而對健康人的造血干細胞的凋亡影響較??；克隆形成實驗顯示，PPP能夠明顯抑制CML CD34+克隆形成，而對健康人CD34+細胞克隆形成的影響較小。
　　2.探討鬼臼苦素抗SCL-tTA/BCR-ABL轉(zhuǎn)基因小鼠LSC的作用
　　2.1.撤去多西環(huán)素4周誘導BCR-ABL表達后，流式細胞術(shù)結(jié)果顯示SCL-tTA/BCR-ABL小鼠的外周血和脾臟中性粒細胞比例明

11、顯增高，骨髓 LSC比例明顯增高；組織HE染色結(jié)果顯示，SCL-tTA/BCR-ABL小鼠脾臟出現(xiàn)明顯的白細胞浸潤，骨髓增生明顯。
　　2.2.經(jīng)PPP治療以后，SCL-tTA/BCR-ABL小鼠和野生型小鼠體重沒有明顯的變化；SCL-tTA/BCR-ABL小鼠骨髓LSC比例和數(shù)量明顯下降，野生型小鼠骨髓LSC比例無明顯變化。
　　3.探討鬼臼苦素抗CML LSC的作用機制
　　3.1.在蛋白水平上，PPP處理后CML

12、 CD34+細胞的P53蛋白磷酸化和乙?；讲⑽疵黠@增加；在mRNA水平上，PPP處理后CML CD34+細胞P53基因表達沒有發(fā)生變化，但是其調(diào)控的促凋亡基因P21、Puma、Noxa、Bax表達明顯增加，抗凋亡基因c-Myc表達水平明顯下降；接受PPP治療后，SCL-tTA/BCR-ABL小鼠骨髓細胞P21和 Noxa表達水平明顯上調(diào)，與體外實驗結(jié)果一致；野生型小鼠骨髓細胞P21明顯上調(diào)，但是Noxa表達無明顯變化。
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13、.2.流式細胞術(shù)和qPCR結(jié)果顯示CML和健康人體內(nèi)IGF1R表達水平無明顯差異；ELISA結(jié)果顯示CML和健康人骨髓上清中IGF1R的配體IGF1、IGF2的表達沒有明顯差異；使用IGF1R siRNA干擾K562細胞IGF1R的表達并不能誘導K562細胞發(fā)生明顯的凋亡；與IGF1R特異性抑制劑相比，PPP并不能有效的抑制IGF1R的活性或者其下游信號通路；與PPP相比，IGF1R特異性抑制劑誘導CML LSC細胞凋亡的能力明顯弱于P