人胚胎干細胞生物學性狀及向內皮分化過程中ID-1基因作用的研究.pdf

1、人胚胎干(hES)細胞系可由移植前囊胚的內細胞團(ICM)建立。近年來雖有報道稱其也可由人卵母細胞孤雌激活產生的囊胚中分離得到或者由終極分化細胞通過轉基因去分化逆轉而成,但由于技術限制,這些方法均尚未作為建立人胚胎干細胞系的常規(guī)方法。其基本特征包括自我更新能力、體內外的多向分化能力、集落形成、正常的染色體核型、體外適當培養(yǎng)條件下的廣泛擴增能力及凍融能力。它們的分化潛能為細胞移植提供了可再生的資源,給患有嚴重退化性疾病的患者帶來了希望。<

2、br>　　 但人胚胎干細胞的研究進展受到倫理問題和資源匱乏的限制。用于人胚胎干細胞建系的囊胚由接受不孕癥治療的患者捐獻。選擇用來移植的胚胎通常是由具有雙原核的合子發(fā)育而來的優(yōu)質囊胚,而差質量或者形態(tài)學異常受精的囊胚才可能用于科學研究。有文獻報道雙倍體的人胚胎干細胞系可以由單原核來源的合子建系得到,而形態(tài)學為多原核受精的合子是否也可建立正常的人胚胎干細胞系,以及形態(tài)學異常受精的合子來源與正常受精的合子來源的人胚胎干細胞系在生物學性狀上有

3、何異同,尚未有明確的報道。在本文第一部分,我們建立了9株人胚胎干細胞系,分別來源于正常(雙原核,2PN)和異常原核(未見原核,0PN；單原核,1PN；三原核,3PN)的合子。通過深入比較各株細胞系的生物學性狀,發(fā)現(xiàn)正常的人胚胎干細胞系可以由臨床棄用的具有形態(tài)學異常原核(0PN,1PN,3PN)的受精合子建立。
　　 人胚胎干細胞是研究胚胎發(fā)育的良好體外模型。在合適的條件下,人胚胎干細胞能自發(fā)分化形成包含多種祖細胞的擬胚體(EB)

4、,其中包括造血系和內皮系。就造血系和內皮系的發(fā)育而言,EB系統(tǒng)與子宮內胚胎的發(fā)育過程相似。TGF-β1作為一種多潛能的細胞因子在血管發(fā)生和血管生成中起重要的調節(jié)作用。在體內和體外TGF-β1對血管內皮細胞的作用非常復雜,它通過其兩種Ⅱ型受體ALK1、ALK5及其下游的Smad家族蛋白對血管生成起雙重調節(jié)作用,這兩種信號轉導強弱的比值決定了TGF-β1的促進或者抑制血管產生的作用。ID蛋白家族是短鏈蛋白(13-20kD)的一個小家族,其功

5、能是作為堿性螺旋一袢一螺旋(bHLH)轉錄因子的主要負性調節(jié)因子。據報道,Id-1基因可以抑制腫瘤細胞和正常細胞的細胞周期阻滯和終端細胞分化。最近又發(fā)現(xiàn),Id-1基因是內皮細胞中ALK1的特異性下游基因,它在TGF-β/ALK1-誘導的(Smad依賴的)信號轉導通路中可以介導內皮細胞的遷移。但是ID-1基因是否為TGF-β1誘導的人胚胎干細胞向內皮分化及形成血管樣結構的信號轉導通路中的下游調控基因,它在該信號傳導通路中有何作用,尚未有確

6、切的研究報道。在本文第二部分,我們以人胚胎干細胞(hESC)的體外分化作為血管內皮發(fā)育的模型,來研究ID-1基因在TGF-β1誘導的人胚胎干細胞定向分化為血管內皮細胞及形成血管樣結構的信號轉導通路中的作用,以探討胚胎早期血管內皮細胞增殖的分子機制。
　　 第一部分由正常和異常原核來源的合子得到的人胚胎干細胞系生物性狀的比較
　　 目的:人胚胎干細胞系可建立于正常和異常受精的合子,然而,這兩種類型的人胚胎干細胞系之間的性狀

7、的異同尚未可知。有文獻報道雙倍體的人胚胎干細胞系可以由單原核來源的合子建系得到,但形態(tài)學為多原核受精的合子是否也可建立正常的人胚胎干細胞系尚無明確報道。為了探索這些問題,我們建立了9株人胚胎干細胞系,分別來源于形態(tài)學正常(雙原核,2PN)和形態(tài)學異常(未見原核,0PN；單原核,1PN；三原核,3PN)原核的合子。通過深入比較其性狀異同,以期解決以上問題。
　　 方法:建立來源于形態(tài)學正常和異常原核的受精合子的hES細胞系及其培養(yǎng)

8、維持。堿性磷酸酶染色及免疫熒光染色檢測各株細胞的“干”性,畸胎瘤形成實驗檢測體內分化能力,RT-PCR分析檢測體外分化能力。核型分析檢測各株細胞的遺傳穩(wěn)定性,DNA質譜分析檢測每株hES細胞的基因組DNA的特異性。流式細胞術分析細胞周期分布情況,BrdU摻入實驗分析細胞系增殖潛力。實時定量PCR分析代表分化及未分化基因的表達水平。hES細胞的神經定向誘導分化檢測神經分化潛能。
　　 結果:我們由46個臨床廢棄的新鮮囊胚建立了9株

9、人胚胎干細胞系(細胞株mSDU-hES1-9),其中5個為2PN來源,2個為0PN來源,1個為1PN來源,1個為3PN來源。由形態(tài)學不同原核來源的合子得到的干細胞系顯示相似的克隆形態(tài),每株細胞系均能成功凍融,均不存在增殖及自我更新障礙。
　　 結論:1.來源于形態(tài)學上不同原核的合子的9株hES細胞系具有相似的大致特征。所有9株細胞表達相似的“干性”標記,包括轉錄因子及糖脂分子標記物:OCT-4,SSEA-3,SSEA-4,TRA

10、-1-60及TRA-1-81；各株細胞的增殖能力及在擬胚體和畸胎瘤中分化為外胚層、內胚層和中胚層細胞系的潛能也具有相似性。在神經定向分化條件下,所有的細胞株均可分化成神經前體和神經元。2.在細胞周期和分化及未分化標記基因的相對表達量等方面存在差異。這些差異在正常來源的不同人胚胎干細胞系之間也同樣存在。這種現(xiàn)象可能決定于不同細胞系本身的生物學特性,而非與形態(tài)學正常或異常原核來源相關。3.正常的人胚胎干細胞系可以由臨床棄用的具有形態(tài)學異常原

11、核的受精合子建立。
　　 第二部分 ID-1基因在TGF-beta1誘導的人胚胎干細胞定向分化為血管內皮細胞中的作用探討
　　 目的:分化抑制子/DNA結合抑制子-1(ID-1)是內皮細胞(ECs)中活化素受體樣激酶-1(ALK1)的特異性下游基因,它介導轉化生長因子-β(TGF-β)/ALK1誘導的(Smad依賴的)內皮細胞遷移。然而,ID-1基因在TGF-β1誘導的人胚胎干細胞向內皮分化及血管發(fā)生的信號轉導通路中的作

12、用,尚未有確切的研究報道。本文以人胚胎干細胞(hESCs)的體外分化作為血管內皮發(fā)育的模型,來研究ID-1基因在TGF-β1誘導的人胚胎干細胞定向分化為血管內皮細胞及血管發(fā)生的信號轉導通路中的作用。
　　 方法:建立TGF-β1誘導的人胚胎干細胞分化為血管內皮細胞及形成血管樣結構的模型,用免疫熒光定性分析不同濃度的TGF-β1對血管內皮定向分化及血管發(fā)生的作用。利用實時定量PCR技術檢測TGF-β1誘導組及對照組中ID-1基因和

13、內皮細胞標志基因PECAM、KDR的表達含量,分析TGF-β1對ID-1基因表達的影響。利用實時定量PCR技術分析TGF-β1誘導的細胞分化和血管發(fā)生過程中ID-1基因表達的時間動力學表現(xiàn)。通過小干擾RNA技術和實時定量PCR技術分析ID-1基因在TGF-β1誘導的人胚胎干細胞分化的血管內皮細胞中的功能。利用實時定量PCR技術和western雜交技術分析分化和血管發(fā)生過程中TGF-β1受體及信號分子蛋白表達的時間動力學表達。
　　

14、 結果:我們發(fā)現(xiàn)在hESCs分化為ECs早期,TGF-β1能夠通過抑制ID-1基因的表達誘導人胚胎干細胞向內皮系的定向分化,在分化晚期的血管發(fā)生階段,TGF-β1通過ALK1/Smad1,5/ID-1信號轉導通路增強ID-1基因的表達而促進內皮細胞增殖。但是TGF-β1在血管生成過程中對于血管出芽卻起抑制作用。另外,TGF-β1誘導的人胚胎干細胞定向分化為血管內皮細胞過程及ID-1基因的表達對于TGF-β1不僅具有時間依賴性,而且具有

15、濃度的依賴性。通過沉默ID-1基因來降調該基因的表達將促進TGF-β1誘導的人胚胎干細胞定向分化為血管內皮細胞而抑制分化的內皮細胞增殖和遷移。
　　 結論:運用TGF-β1誘導的人胚胎干細胞分化模型,我們分析了在向內皮系分化及分化的內皮細胞增殖過程中ID-1基因的功能。我們的數據表明,在分化過程中TGF-β1可以通過ALK5通路刺激內皮方向的分化,而在增殖過程中則通過TGF-β1/ALK1/ID-1,Smad1/Smad5依賴的