牙鲆甲狀腺激素受體TRαA的原核表達和多克隆抗體的制備及其應用.pdf

1、牙鲆是鰈形目魚類中一種重要的海水養(yǎng)殖經濟魚類。在其早期發(fā)育過程中，經歷一從仔魚到稚魚的變態(tài)發(fā)育過程，最典型的變態(tài)現(xiàn)象是右眼向身體左側遷移，從而使兩只眼睛同時位于身體的一側。伴隨著右眼移位，仔魚在形態(tài)結構、生理機能和行為方式等方面都發(fā)生了變化，其頭部腦顱骨骼也發(fā)生巨大的形態(tài)結構改變，表現(xiàn)為左右（L/R）不對稱。脊椎動物分泌合成兩種亞型的甲狀腺激素（THs）：三碘甲腺原氨酸（T3）和甲狀腺素（T4），其在哺乳動物、兩棲類的早期發(fā)育和變態(tài)中發(fā)

2、揮重要的作用，最近的研究發(fā)現(xiàn)THs在鰈形目魚類的變態(tài)發(fā)育中同樣起著非常重要的作用。研究表明甲狀腺激素在牙鲆變態(tài)發(fā)育中起著核心作用，THs主要通過與受體結合發(fā)揮其生物學效應，調節(jié)相關基因的表達，從而起到對細胞生長、發(fā)育、新陳代謝的調控作用。甲狀腺激素受體TR是配體依賴型轉錄因子，屬類固醇類核受體超家族成員，TR可特異性識別甲狀腺激素反應元件（TREs）序列，通過與TREs結合，TR激活或抑制下游靶基因轉錄。因此，研究牙鲆變態(tài)發(fā)育的分子機制

3、，揭示其甲狀腺激素基因調控網絡，對闡述牙鲆變態(tài)機理具有重大意義。 本實驗首先根據GenBank登陸的牙鲆甲狀腺激素受體TRαA cDNA序列設計特異性引物，其中上游引物加入EcoRⅠ酶切位點，下游引物加入HindⅢ酶切位點，提取牙鲆仔魚頭部總RNA，通過RT-PCR獲得TRαA cDNA片段，將目的基因克隆至原核表達載體pET-30a上，雙酶切鑒定正確后進行DNA測序，構建了牙鲆甲狀腺激素受體TRαA原核表達載體pET-30a-

4、TRαA。挑選測序正確的重組質粒轉化基因工程大腸桿菌BL21（DE3），雙酶切鑒定后，挑取陽性用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導表達重組融合蛋白TRαA，成功表達了38kD大小的重組蛋白TRαA，進行目的蛋白表達的可溶性檢測，發(fā)現(xiàn)其以包涵體形式存在，包涵體變性后利用原核表達載體pET-30aN端的His-Tag采用金屬螯合層析對重組蛋白進行純化，得到了純度較高的目的蛋白，SDS-PAGE電泳分析該蛋白純度達到了95％，并對重

5、組蛋白成功的進行了復性，Western Blot檢測鑒定表達產物。蛋白經復性后皮下多點注射免疫新西蘭家兔，經4次免疫后，頸動脈采血制備抗TRαA的多克隆抗體，通過Dot Blot印跡檢測抗體效價，在抗體稀釋度為1：200000時仍出現(xiàn)陽性斑點著色，說明抗體的效價達到1：200000以上，表達的重組蛋白TRαA具有良好的免疫原性，制備的多克隆抗體對于識別表達的重組蛋白TRαA具有較好的特異性。親和層析法純化特異性抗體。通過染色質免疫沉淀技

6、術，鑒定在活體細胞中多克隆抗體與TRαA的特異性結合，根據牙鲆堿性磷酸酶基因（ALP）5’調控區(qū)甲狀腺激素應答元件（TRE）序列設計特異性引物，以ChIP-DNA為模板，PCR擴增ALP基因啟動子區(qū)TRE結合位點。成功擴增了牙鲆堿性磷酸酶基因（ALP）5’調控區(qū)甲狀腺激素應答元件（TRE）結合位點，結果提供了甲狀腺激素通過其受體在體內參與堿性磷酸酶基因（ALP）的轉錄調控的依據。 本研究工作為今后進一步研究甲狀腺激素調控的分子機