囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)的動(dòng)態(tài)跟蹤及其與脂筏關(guān)系的初步研究.pdf

1、細(xì)胞物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)質(zhì)上是細(xì)胞內(nèi)的一個(gè)龐大而復(fù)雜的物流系統(tǒng)，這一系統(tǒng)的異常將導(dǎo)致相應(yīng)各種疾病的發(fā)生。囊泡是這一物流系統(tǒng)中的一種可調(diào)控的重要的運(yùn)輸工具，脂筏是膜脂雙層內(nèi)含有特殊脂質(zhì)及蛋白質(zhì)的微區(qū)，在這一物流系統(tǒng)中具有重要的作用。本課題引入單分子研究技術(shù)和全內(nèi)反射熒光成像技術(shù)，實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)地研究轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡的動(dòng)力學(xué)過程，和兩類脂筏與囊泡之間的動(dòng)態(tài)空間定位關(guān)系。這一研究有助于我們進(jìn)一步揭示囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制和糖尿病的發(fā)生機(jī)制，而且對(duì)于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)脂筏功能及開發(fā)以G

2、LUT4為靶的調(diào)節(jié)血糖的藥物都具有重要的理論及實(shí)際指導(dǎo)意義。機(jī)體內(nèi)葡萄糖的平衡對(duì)生命過程至關(guān)重要。胰島素是調(diào)節(jié)血糖平衡的重要激素，它促進(jìn)葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而降低血中葡萄糖。胰島素的這一作用是通過細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(GlucoseTransporter,GLUT)家族之一葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子4(GLUT4)將葡萄糖從細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)的。研究表明II型糖尿病的發(fā)生與細(xì)胞內(nèi)GLUT4的轉(zhuǎn)運(yùn)障礙有關(guān)。而GLUT4的轉(zhuǎn)運(yùn)被認(rèn)為是受多種因素控制的，這

3、些因素目前較公認(rèn)的有GLUT4在細(xì)胞器中的保持機(jī)制、動(dòng)態(tài)分選、囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)、錨定和與質(zhì)膜的融合以及質(zhì)膜的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)。GLUT4在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)至少有兩個(gè)循環(huán)，一個(gè)是細(xì)胞表面和內(nèi)涵體間的循環(huán)，一個(gè)是在trans-Golginetwork(TGN)和內(nèi)涵體間的循環(huán)。在這兩個(gè)循環(huán)中GLUT4轉(zhuǎn)位有幾個(gè)嚴(yán)格的控制點(diǎn)。這兩個(gè)循環(huán)似乎告訴我們GLUT4在胞內(nèi)可能有兩種運(yùn)動(dòng)形式。為了回答這個(gè)問題，我們研究了GLUT4在胞內(nèi)的動(dòng)力學(xué)過程。在研究過程中使用Co

4、nfocal顯微鏡觀察了GLUT4在胞內(nèi)的整體分布。使用全內(nèi)反射熒光顯微鏡時(shí)序成像獲得了GLUT4的動(dòng)態(tài)連續(xù)的圖像，用于三維動(dòng)力學(xué)分析。分析中發(fā)展了單顆粒追蹤方法(SPT)，使之能跟蹤亞象素的位移，發(fā)現(xiàn)GLUT4在胞內(nèi)雖然有兩個(gè)循環(huán)路徑，但是在無刺激的情況下，它的運(yùn)動(dòng)呈現(xiàn)限制性運(yùn)動(dòng)，其分散系數(shù)呈現(xiàn)一種連續(xù)的平滑的分布，即其運(yùn)動(dòng)并未因循環(huán)有兩個(gè)路徑而分成幾種形式。此外，我們初步研究了囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)與細(xì)胞膜脂筏的關(guān)系。首先構(gòu)建了含熒光標(biāo)記的Cav

5、eolin和flotillin兩類脂筏特異性蛋白表達(dá)質(zhì)粒。研究了它們分別與大囊泡標(biāo)記物NPY的動(dòng)態(tài)定位關(guān)系。發(fā)現(xiàn)Caveolin無論是在靜息還是在高鉀刺激下都沒有明顯的與NPY大囊泡的共存，與SNAP25也沒有明顯的共存現(xiàn)象。同樣flotillin與NPY大囊泡也沒有明顯的共存關(guān)系，而且flotillin自身在TIRFM下呈一種片狀分布，這說明flotillin在表達(dá)后即分布在細(xì)胞膜上。從定位關(guān)系看脂筏標(biāo)記蛋白沒有明顯的參與大囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)