脂肪干細(xì)胞微環(huán)境對衰老成纖維細(xì)胞作用及機制的研究.pdf

1、皮膚的老化是人體衰老最突出的表現(xiàn)之一，減緩皮膚的衰老一直是人們追求的目標(biāo)。其中真皮成纖維細(xì)胞是皮膚中主要功能細(xì)胞之一，也是皮膚抗衰老的主要目標(biāo)細(xì)胞。脂肪干細(xì)胞（ adipose-derived stem cells, ASCs）存在于成熟脂肪組織中，其含量豐富，提取簡便，供區(qū)易被患者接受，被認(rèn)為是有極大應(yīng)用前景的干細(xì)胞。多個研究證實脂肪干細(xì)胞據(jù)報道可旁分泌多種細(xì)胞因子，包括炎癥因子、血管源性因子、生長因子等等。這些細(xì)胞因子構(gòu)成了ASCs

2、生長的微環(huán)境，通過多種途徑對周圍組織和細(xì)胞產(chǎn)生作用和影響。ASCs本身的分化數(shù)量相對較少，它們更像組織細(xì)胞活動的組織者，而不是參與者。有許多研究表明ASCs生物活性的生長因子可與周圍組織和細(xì)胞進行信號傳導(dǎo)，并表現(xiàn)出對傷口愈合，組織修復(fù)和抗衰老的積極作用。但ASCs微環(huán)境對成纖維細(xì)胞的長時間作用尚未見報道。ASCs微環(huán)境是否會改變成纖維細(xì)胞的衰老狀態(tài)，通過何種機制改變，這些問題都尚不清楚。細(xì)胞的衰老本身也是細(xì)胞的一種自我保護機制，防止細(xì)胞

3、在外界刺激下過度增殖甚至形成腫瘤。其中p53/p21通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、導(dǎo)致細(xì)胞衰老、防止腫瘤發(fā)生的重要信號通路。本課題將用人脂肪干細(xì)胞及人真皮成纖維細(xì)胞進行非接觸性間接共培養(yǎng)，進一步研究脂肪干細(xì)胞微環(huán)境對真皮成纖維細(xì)胞的作用，并通過測定成纖維細(xì)胞衰老相關(guān)性beta-半乳糖苷酶研究成纖維細(xì)胞衰老狀態(tài)的改變，另外還通過p53、p21蛋白的表達，研究ASCs微環(huán)境對細(xì)胞復(fù)制及應(yīng)激衰老相關(guān)的p53/p21信號通路的變化。
　　一、人脂肪

4、干細(xì)胞分離、培養(yǎng)、鑒定及與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)體系的建立
　　目的：為研究人 ASCs微環(huán)境與對真皮成纖維細(xì)胞的作用，需分離培養(yǎng) ASCs與成纖維細(xì)胞，并用 Transwell小室構(gòu)建細(xì)胞間接共培養(yǎng)體系。
　　方法：（1）各取5例青年人（年齡<30歲）及老年人（年齡>60歲）整塊腹部皮下脂肪組織（約5g）做CD44免疫組織化學(xué)染色，每張切片選擇4個視野做陽性細(xì)胞計數(shù)并觀察CD44細(xì)胞分布。（2）用負(fù)壓針管抽吸或切除的脂肪組織分離

5、培養(yǎng)ASCs，并用流式細(xì)胞儀對 CD34、CD44、CD90做細(xì)胞鑒定。（3）分離培養(yǎng)人真皮成纖維細(xì)胞，并用Transwell小室與ASCs構(gòu)建間接細(xì)胞共培養(yǎng)體系。
　　結(jié)果：（1）脂肪組織的免疫組化染色發(fā)現(xiàn) CD44+細(xì)胞主要位于纖維結(jié)締組織中，與血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密聯(lián)系。（2）用脂肪組織培養(yǎng)的原代 ASCs的表面抗原表達為 CD34（-）、CD44（+）、CD90（+）。（3）用Transwell小室成功建立ASCs與成纖維細(xì)胞間

6、接共培養(yǎng)體系。
　　結(jié)論：CD44+細(xì)胞主要位于脂肪的纖維結(jié)締組織中，用注射器抽取的游離脂肪組織可以增加膠原酶消化效率，得到足夠的原代ASCs，其抗原表達為CD34（-）、CD44（+）、CD90（+）。用Transwell小室可以構(gòu)建ASCs與成纖維細(xì)胞間接共培養(yǎng)體系。
　　二、脂肪干細(xì)胞微環(huán)境對真皮成纖維細(xì)胞功能的影響
　　目的：研究脂肪干細(xì)胞旁分泌因子所構(gòu)成的微環(huán)境對不同年齡人成纖維細(xì)胞功能的影響。
　　方

7、法：本實驗將成纖維細(xì)胞分成4個組，分別在培養(yǎng)后24h、48h、72h用細(xì)胞增殖比色法MTT（四唑鹽）法檢測各組成纖維細(xì)胞增殖情況；用實時定量（real-time） PCR檢測I型膠原，基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MMP-1）mRNA在成纖維細(xì)胞中的表達。
　　結(jié)果：共培養(yǎng)組的青年和老年HDFs的細(xì)胞增殖均顯著高于相應(yīng)對照組（P<0.01）。共培養(yǎng)老年HDFs的MMP-1 mRNA表達與對照組比較在48h后均顯著降低（P<0.01）。其中共

8、培養(yǎng)組MMP-1表達在48h時顯著下降（P<0.01），但在72h時下降趨勢停止（P>0.05）。在對照組， MMP-1的表達隨著時間延長逐漸升高（P<0.05）。在前48 h中，共培養(yǎng)的老年HDFs的I型膠原蛋白的表達呈現(xiàn)逐漸增加，然后在72h略微下降（P>0.05）。共培養(yǎng)青年HDFs的I型膠原表達在也前48h顯著升高（P<0.01），并在72h顯著下降（P<0.05）。對照組成纖維細(xì)胞的I型膠原的表達在24h和48h無顯著差異（P

9、>0.05），而青年對照組I型膠原表達在72h出現(xiàn)下降（P<0.05）。
　　結(jié)論：本部分實驗結(jié)果表明脂肪干細(xì)胞微環(huán)境可促進共培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞的增殖，同時減少MMP-1的產(chǎn)生，并增加I型膠原的表達。結(jié)果表明脂肪干細(xì)胞微環(huán)境可促進細(xì)胞增殖，改善細(xì)胞的功能。但這種促進作用隨著共培養(yǎng)時間的進一步延長逐漸減小，表明脂肪干細(xì)胞微環(huán)境可能無法長時間改善成纖維細(xì)胞的功能。
　　三、人脂肪干細(xì)胞微環(huán)境對成纖維細(xì)胞衰老狀態(tài)的改變及對p53/p

10、21通路的影響
　　目的：探索 ASCs微環(huán)境對成纖維細(xì)胞衰老狀態(tài)的作用及對p53/p21通路的影響
　　方法：分別在培養(yǎng)后24h、48h、72h用real-time PCR法檢測各組成纖維細(xì)胞衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶mRNA的變化；用western blot法檢測各組成纖維細(xì)胞p53、p21蛋白的表達。
　　結(jié)果：兩個對照組成纖維細(xì)胞在第一個24h時在SA-β-Gal的表達無顯著差異（P>0.05），培養(yǎng)24小時后各組

11、HDFs中SA-β-Gal的mRNA表達水平的逐漸增加（P<0.05）。老年組HDFs的SA-β-Gal的在每個時間點均表現(xiàn)出更高的表達水平（P<0.01）。兩個共培養(yǎng)組中的SA-β-Gal的表達較對照組顯著增加更顯著（P<0.05）。在各時間點ASCs共培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞的p53蛋白較對照組的表達均顯著升高（P<0.05），p21蛋白表達的檢測結(jié)果表現(xiàn)出與 p53蛋白類似的逐漸升高的趨勢（P<0.05），但其升高的幅度要小于p53蛋白。